Diferenciální výraz. Diferenciální genová exprese

Většina eukaryotických genů má na rozdíl od prokaryotických genů intermitentní strukturu. Relativně krátké kódující oblasti (exony) se střídají s nekódujícími oblastmi (introny). Regulační elementy genu - promotory, které určují přesnost iniciace a transkripce, jsou umístěny před prvním exonem na 5" konci řetězce DNA a jsou reprezentovány několika elementy (TATA, CCAAT boxy, GC motiv).

Genová exprese je také regulována zesilovači (enhancery), atenuátory (tlumiče), stejně jako izolátory (omezovače účinku zesilovačů) a reakčními prvky, které interagují s transkripčními faktory, xenobiotiky, steroidními hormony atd. Tyto sekvence se podílejí na určování frekvence iniciace transkripce.

První fází implementace genetické informace je transkripce. Eukaryotické geny jsou transkribovány jako prekurzor, který se skládá z exonů a intronů (nezralé mRNA). Poté jsou introny štěpeny speciálními enzymy a exony jsou postupně vzájemně spojeny, čímž se vytvoří transkript připravený k translaci (zralá mRNA). Tento proces se nazývá spojování. Stejná sekvence DNA může kódovat více různých proteinů, a to díky tzv. alternativnímu sestřihu (vznik různých mRNA změnou střídání spojení exonů z jednoho primárního transkriptu RNA).

Po transkripci nebo paralelně s ní prochází nezralá mRNA další modifikací. Metylovaný guaninový zbytek na 7. pozici purinového kruhu je připojen k 5" konci pre-mRNA enzymem (proces kopírování). Má se za to, že čepička (čepice) je nezbytná pro správnou orientaci a připojení ribozomů K α-konci pre-mRNA je také enzymaticky připojena krátká nukleotidová sekvence sestávající z adeninových zbytků (polyadenylace). Předpokládá se, že poly-A sekvence je nutná pro transport mRNA přes jadernou membránu do cytoplazmy.

Podle funkce v buňce se eukaryotické geny dělí do několika skupin.

První skupinu tvoří geny, které jsou exprimovány ve všech typech buněk. Produkty jejich činnosti jsou proteiny, které jsou nezbytné k zajištění vitální činnosti jakékoli buňky v těle (geny ribozomální RNA, histony atd.).

Druhou skupinou jsou tkáňově specifické geny, které fungují pouze v určitých typech buněk nebo tkání v určitých fázích ontogeneze (geny pro globuliny, albumin, α-fetoprotein, imunoglobuliny, svalové proteiny, sekreční proteiny endokrinních a trávicích žláz a mnohé další ostatní).

Třetí skupinu tvoří geny, které kódují různé proteiny podílející se na regulaci transkripce (transkripční faktory). Proteinové produkty těchto genů interagují s regulačními oblastmi genů, což způsobuje zvýšení nebo potlačení exprese.

Do čtvrté skupiny patří geny, jejichž exprese je indukována vnějšími faktory, včetně xenobiotik.

Jedním z hlavních úkolů farmakogenomiky je studium genové exprese u různých onemocnění a účinku konkrétního léčiva nebo biologicky aktivní sloučeniny. To umožní určit možnost jejich řízené regulace.

Úspěšné zavedení farmakogenomiky do experimentální farmakologie bylo možné díky rozvoji vhodných technologií, včetně informačních technologií (bioinformatika). Všichni asimilovali a integrovali farmakogenetiku do širokého vědeckého oboru.

Obecně se všechny metody DGE skládají z mnoha, často opakovaných, stejných operací. Jejich ruční provádění není příliš zajímavé. Ohrožením však není monotónní práce operátora a za mnohem větší problém je považováno nekonečné opakování stejných operací, které může vést ke ztrátě přesnosti. Farmakogenomické technologie proto mají jeden úkol – částečnou nebo úplnou automatizaci analytických operací.

Základem každé technologie je metoda, která má v analytické praxi své charakteristiky (parametry). Pro DHE musí splňovat následující požadavky:

Rozlišení je spojeno s určitou přesností při určování sousedních genů;

Citlivost - hranice "-sekvencí ředění, které umožňují statisticky spolehlivě zaznamenat změny DHE;

Pokrytí je procento vyjádřených genů daného druhu pokusného zvířete nebo specifické tkáně, které lze spolehlivě identifikovat a experimentálně replikovat;

Falešně pozitivní norma - počet genů omylem připisovaných vyjádřeným;

Falešně negativní norma - počet exprimovaných genů, klasifikovaných však jako neaktivní.

Technologie DHE zahrnují dvě skupiny metod. Jedním z nich je tzv. uzavřený a druhým otevřený architektonický systém.

Uzavřený architektonický systém vyžaduje informace o každém genu nebo klonu a jako analyzátor používá mikročipy.

Teorie vytváření mikročipů je založena na hybridizaci oligonukleotidů známé sekvence, imobilizovaných na pevném povrchu na přesně definovaných místech, se vzorkem různě značeným. Vytvoření této technologie bylo usnadněno nejnovějšími pokroky v informatice, chemii polovodičů, mikroelektronickém průmyslu a také množstvím informací, které se nashromáždily za léta práce na programu Human Genome.

DNA čip je miniaturní destička s mikrobuňkami. Každá mikrobuňka obsahuje uměle syntetizované oligonukleotidy odpovídající fragmentům specifických genů, které fungují jako templát. V těchto buňkách dochází ke komplementární interakci templátu a vzorku (cDNA studovaných vzorků). V současné době existují dva směry ve vytváření čipů DNA. Liší se způsobem syntézy a aplikací templátových oligonukleotidů.

První směr je založen na předběžné syntéze oligonukleotidů. Oligonukleotidy jsou syntetizovány chemicky nebo pomocí PCR (500 až 5000 bází na délku) a poté pomocí robotů aplikovány na speciálně upravený povrch skla. Tyto typy čipů se nazývají cDNA microarrays. PCR amplifikuje cDNA sekvence specifických genů. Proto je tento typ čipu drahý, protože je nutné vytvořit vlastní cDNA knihovnu nebo ji zakoupit ve velkých výzkumných centrech.

Ukázalo se, že cDNA microarrays nejsou vhodné pro studium polymorfismu (genetická variabilita jednotlivého lokusu v určité populaci), mutační analýzu, srovnávací studium exprese velkého počtu genů, protože hustota matricových oligonukleotidů je velmi omezená ( počet buněk je = 1000 na čip). Použití dlouhých fragmentů DNA (cDNA) navíc snižuje specificitu hybridizace s testovaným vzorkem a objevují se falešně pozitivní signály, které neodpovídají skutečné genové expresi.

Navzdory uvedeným nevýhodám je hlavní výhodou cDNA microarrays schopnost měnit kvalitativní a kvantitativní složení genových fragmentů.

Slibnějším směrem při tvorbě čipů je použití fotolitografických technologií, které umožňují současně integrovat obrovské množství oligonukleotidů libovolné sekvence přímo na povrch čipu. Hustota takto syntetizovaných nukleotidů může dosáhnout 1 milionu na 1 cm2. Tyto čipy, nazývané DNA-čipy, vyrábí společnost Affymetrix Inc. Templát DNA čipu je krátká (20-25-rozměrná) oligonukleotidová sekvence, přičemž každý gen odpovídá 15-20 takovým oligonukleotidům, což významně zvyšuje přesnost a reprodukovatelnost výsledků. DNA čipy umožňují současně vyhodnocovat expresi téměř neomezeného počtu genů, studovat polymorfismus včetně jednonukleotidových substitucí (SNP). V tomto případě jsou syntetizovány oligonukleotidy, které jsou specifické pro každou sekvenci konkrétního genu s přihlédnutím ke všem možným variantám vzájemného uspořádání nukleotidů.

Při provádění výzkumu se čip hybridizuje se vzorkem označeným různými způsoby. Ve srovnávacích studiích je vzorkem obvykle cDNA získaná z kontrolních a porovnávaných vzorků. Jako značka se používají jak radioaktivně značené molekuly, tak fluorescenční barviva přímo navázaná na studované vzorky. Při provádění srovnávací analýzy se obvykle používá dvoubarevná detekce, při které jsou kontrolní a experimentální cDNA značeny různými barvivy. Výsledky jsou zaznamenávány intenzitou hybridizačních signálů těch buněk čipu, kde došlo k hybridizaci, s následným počítačovým zpracováním dat.

Vyrábějí se také zjednodušené verze čipů s malou sadou genů (v rozmezí 1000-2000). Krátké sekvence známých genů jsou fixovány na nylonové membráně. Hybridizují se s radioaktivně značeným vzorkem. Hybridizace je detekována rádiovou autografií.

Je třeba poznamenat, že práce s čipy vyžaduje speciální drahé vybavení pro hybridizaci. Očekává se, že v následujících letech dojde z důvodu nasycení trhu ke snížení cen sad zařízení na výrobu čipů a práci s nimi.

Vývoj a implementace nových technologií ve vědě a praxi je často hnacím momentem v rozvoji biomedicínských oborů poznání, jako např. s rozvojem technologie PCR v nedávné minulosti. Rozvoj molekulární biologie je nyní z velké části způsoben PCR a nyní mikročipy. Zavedení technologie mikročipů je rovněž zásadní pro farmakologii. Vývoj nových léků již začíná být založen na informacích o funkční úloze určitých genů ve vývoji patologie. Proto lze dobu vývoje zkrátit z 10-15 na 5-8 let. od Harmara Hilleryho

Role krycího psa v procesu krytí Jakmile je pes dostatečně stimulován fenou a chce se pářit, vyšplhá se na ni a pevně ji uchopí předníma nohama, špička penisu se vysune z předkožky a po sérii silných pokusů

Z knihy Služební pes [Průvodce výcvikem specialistů na chov služebních psů] autor Krušinskij Leonid Viktorovič

5. Teorie etapovitého vývoje a rysy vývoje živočichů Jádrem řízení vývoje organismů je teorie etapovitého vývoje, kterou zformuloval akademik TD Lysenko, vycházející z prací IV. Mičurina a řady dalších jeho vlastní studia.

Z knihy Biologie [Kompletní průvodce přípravou na zkoušku] autor Lerner Georgij Isaakovič

Z knihy Základy psychofyziologie autor Alexandrov Jurij

DIFERENCIÁLNÍ CITLIVOST SNÍMAČE Rozdílná senzorická citlivost je založena na schopnosti senzorického systému rozlišovat mezi signály. Důležitou charakteristikou každého smyslového systému je schopnost všímat si zároveň rozdílů ve vlastnostech, popř

Z knihy Embrya, geny a evoluce autor Raff Rudolph A

2.12. Diferenciální citlivost vidění Pokud na osvětlenou plochu s jasem I dopadá další osvětlení dI, pak podle Weberova zákona člověk zaznamená rozdíl v osvětlení pouze tehdy, když dI / I = K, kde K je konstanta rovna 0,01–0,015. Nazývá se veličina dI / I

Z knihy Akvárium ve škole autor Machlin Mark Davidovič

Kapitola 17 DIFERENCIÁLNÍ PSYCHOFYZIOLOGIE

Z knihy Problémy léčebného hladovění. Klinický a experimentální výzkum [všechny čtyři části!] autor Anokhin Petr Kuzmich

Buněčná smrt během normálního vývoje Degenerace vlčích kanálků během vývoje samic a Müllerových kanálků u samců jsou příklady přítomnosti struktur, které se nejprve vyvinou a poté podléhají nekróze. Tyto procesy,

Z autorovy knihy

Geny, které vstupují do činnosti v pozdějších fázích vývoje a během růstu Je jasné, že mutace v genech, které přímo určují morfogenetické dráhy, zejména těch genů, které působí v raných fázích, mohou způsobit extrémně dramatické změny

Z autorovy knihy

Kapitola 10 Adaptace genové exprese v procesu vývoje Život je síla, která provádí nespočet experimentů, snažících se organizovat sám sebe... mamut a člověk, myš a megatherium, mouchy a církevní otcové – to vše jsou výsledky více či méně úspěšných pokusů

Z autorovy knihy

Kolik genů je potřeba pro vývoj? Naštěstí existují metody, jak odhadnout množství dostupné genetické informace u vyšších organismů. Jednou z nejjemnějších z těchto metod je klasická mendelovská genetika. Hlavní obtíž s tím spojená

Z autorovy knihy

VÝZNAM AKVÁRIA V PROCESU UČENÍ Akvária vždy přitahují děti různého věku, překvapují je a probouzejí jejich zvědavost. Ale ve školním prostředí, kdy je úkolem využít akvárium v hodinách botaniky, zoologie, všeobecně; biologie, jeho

Z autorovy knihy

Stav pacientů v průběhu léčby Na základě klinických pozorování a laboratorních studií dynamiky klinického stavu pacientů v průběhu léčby bylo možné zaznamenat 6 fází, z nichž 3 se týkají období vyložení a 3 období zotavení. .

Stručný popis

Ontogeneze je nepřetržitý proces kvantitativních a kvalitativních změn probíhajících v těle po celý život s neustálou interakcí genotypu a podmínek prostředí. Pojmy „ontogeneze“ a „fylogeneze“ zavedl do biologie zoolog E. Haeckel. Pod pojmem "ontogeneze" se rozumí proces individuálního vývoje jedince, "fylogeneze" - historie vývoje druhu. Individuální vývoj jedince je podle biogenetického zákona jakoby krátkým opakováním fylogeneze.

Úvod
Co je diferenciace?
Cytogenetický základ diferenciace v ontogenezi
Diferenciace somatické buňky v ontogenezi
Diferenciální genová exprese
závěry
Bibliografie

Přiložené soubory: 1 soubor

Vizuální pozorování pod elektronovým mikroskopem jako nejpřímější přístup ke studiu úrovně transkripce, tzn. genová aktivita, prováděná ve vztahu pouze k jednotlivým genům – ribozomálním, genům chromozomů jako jsou štětce lamp a některé další. Elektronogramy jasně ukazují, že některé geny jsou přepisovány aktivněji než jiné. Neaktivní geny jsou také dobře rozlišitelné.

Zvláštní místo zaujímá studium polytenových chromozomů. Polytenní chromozomy jsou obří chromozomy, které se nacházejí v mezifázových buňkách určitých tkání u much a jiných dvoukřídlých. Takové chromozomy mají v buňkách slinných žláz, malpighických cév a středního střeva. Obsahují stovky řetězců DNA, které byly zdvojeny, ale nebyly štěpeny. Při obarvení vykazují jasně výrazné příčné pruhy nebo disky. Mnoho jednotlivých pásů odpovídá umístění jednotlivých genů. Omezený počet určitých pruhů v některých diferencovaných buňkách tvoří vybouleniny nebo chmýří, vyčnívající za chromozom. Tyto oteklé oblasti jsou místa, kde jsou geny nejaktivnější z hlediska transkripce. Bylo prokázáno, že různé typy buněk obsahují různé obláčky. Změny v buňkách, ke kterým dochází během vývoje, jsou v korelaci se změnami v charakteru chuchvalců a syntézou konkrétního proteinu. Jiné příklady vizuálního pozorování genové aktivity zatím neexistují.

Všechny ostatní fáze genové exprese jsou výsledkem komplexních modifikací produktů primární genové aktivity. Komplexní změny znamenají posttranskripční transformace RNA, translaci a posttranslační procesy.

Existují údaje o studiu kvantity a kvality RNA v jádře a cytoplazmě buněk organismů v různých fázích embryonálního vývoje a také v buňkách různých typů u dospělých. Bylo zjištěno, že složitost a počet různých typů jaderné RNA je 5-10krát vyšší než u mRNA. Nukleární RNA, které jsou primárními produkty transkripce, jsou vždy delší než mRNA. Kromě toho je jaderná RNA studovaná u mořského ježka identická co do množství a kvalitativní rozmanitosti v různých fázích vývoje jedince a cytoplazmatická mRNA je v buňkách různých tkání odlišná. Toto pozorování vede k myšlence, že post-transkripční mechanismy ovlivňují diferenciální genovou expresi.

Příklady post-transkripční regulace genové exprese na úrovni zpracování jsou známy. Forma imunoglobulinu IgM vázaná na membránu u myší se liší od rozpustné formy další aminokyselinovou sekvencí, která umožňuje formě vázané na membránu „ukotvit se“ v buněčné membráně. Oba proteiny jsou kódovány stejným lokusem, ale zpracování primárního transkriptu probíhá různými způsoby. Peptidový hormon kalcitonin u potkanů je reprezentován dvěma různými proteiny určenými stejným genem. Mají stejných prvních 78 aminokyselin (s celkovou délkou 128 aminokyselin) a rozdíly jsou způsobeny zpracováním, tzn. opět je pozorována rozdílná exprese stejného genu v různých tkáních. Existují i další příklady. Velmi důležitou roli v diferenciaci hraje pravděpodobně alternativní zpracování primárních transkriptů, ale jeho mechanismus zůstává nejasný.

Většina cytoplazmatické mRNA je z hlediska kvalitativního složení stejná v buňkách patřících do různých stádií ontogeneze. mRNA jsou nezbytné pro životně důležitou aktivitu buněk a jsou určeny provozními geny přítomnými v genomu ve formě několika nukleotidových sekvencí s průměrnou frekvencí opakování. Produkty jejich činnosti jsou proteiny potřebné pro sestavení buněčných membrán, různých subcelulárních struktur atd. Množství těchto mRNA je přibližně 9/10 všech cytoplazmatických mRNA. Zbytek mRNA je vyžadován pro určitá stádia vývoje, stejně jako pro různé typy buněk.

Při studiu diverzity mRNA v ledvinách, játrech a mozku myší, ve vejcovodech a játrech kuřat bylo nalezeno asi 12 000 různých mRNA. Pouze 10-15 % bylo specifických pro kteroukoli tkáň. Čtou se z jedinečných nukleotidových sekvencí těch strukturních genů, jejichž působení je specifické v daném místě a v daném okamžiku, kterým se říká „luxusní“ geny. Jejich počet odpovídá přibližně 1000-2000 genům odpovědným za buněčnou diferenciaci.

Ne všechny geny přítomné v buňce jsou obecně realizovány před fází tvorby cytoplazmatické mRNA, ale tyto vytvořené mRNA nejsou všechny a za žádných podmínek nejsou realizovány do polypeptidů, a ještě více do komplexních znaků. Je známo, že některé mRNA jsou blokovány na úrovni translace, jsou ve složení ribonukleoproteinových částic - informosomů, v důsledku čehož je translace zpožděna. K tomu dochází v ovogenezi, v buňkách oční čočky.

V některých případech je konečná diferenciace spojena s "kompletací" molekul enzymu nebo hormonu nebo kvartérní struktury proteinu. To už jsou události po odvysílání. Například enzym tyrosináza se objevuje v embryích obojživelníků v časné embryogenezi, ale stává se aktivním až po vylíhnutí.

Dalším příkladem je buněčná diferenciace, při níž získávají schopnost reagovat na určité látky nikoli ihned po syntéze odpovídajícího receptoru, ale až v určitém okamžiku. Bylo prokázáno, že svalová vlákna ve své membráně mají receptory pro mediátorovou látku acetylcholin. Je však zajímavé, že tyto cholinergní receptory byly nalezeny uvnitř cytoplazmy myoblastových buněk ještě před jejich tvorbou svalových vláken a citlivost na acetylcholin se objevila až od okamžiku, kdy byly receptory vloženy do plazmatické membrány při tvorbě svalových tubulů a svalů. vlákna. Tento příklad ukazuje, že genovou expresi a tkáňovou diferenciaci lze regulovat po translaci během interakcí buňka-buňka.

Po prozkoumání všech výše uvedených skutečností můžeme vyvodit závěry: diferenciace buněk se neomezuje pouze na syntézu specifických proteinů, a proto, jak je aplikováno na mnohobuněčný organismus, je tento problém neoddělitelný od časoprostorových aspektů, a tedy od ještě vyšších úrovně jeho regulace než úrovně regulace biosyntézy proteinů na buněčné úrovni. Diferenciace působí vždy na skupinu buněk a odpovídá úkolům zajištění celistvosti mnohobuněčného organismu.

Bibliografie