Farmakokinetika a studium biologické dostupnosti - Journal of Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. Použití OF HPLC a kapilární chromatografie aminokyselin a peptidů

přepis

1 NOVOSIBIRSKÁ STÁTNÍ UNIVERZITA Fakulta přírodních věd Katedra analytické chemie Práce na kurzu Predikce retenčních objemů a UV spekter peptidů v reverzní fázi HPLC Provedl: Kuchkina A.Yu., gr. 147 Školitel: Ph.D. Azarova I.N. Novosibirsk-2005

2 OBSAH 1. Úvod Literární přehled 2.1. Peptidy. Aminokyselinová HPLC peptidů Predikce retenčních objemů a UV spekter peptidů v RP HPLC Experimentální část Výsledky a diskuse 4.1. Sledování stability chromatografického systému Výpočet retenčních objemů peptidů Lineární model "retence složení" Nelineární model "retence složení" Výpočet UV spekter peptidů Závěry Odkazy Příloha

3 1. ÚVOD Identifikace proteinů fungujících v živých buňkách na základě známých informací o struktuře genomové proteomiky je považována za jeden z nejdůležitějších úkolů moderní molekulární biologie. Tento problém se objevil po úplném dekódování genomů některých organismů v posledních několika letech. Ukázalo se, že genomy kódují mnohem více bílkovin, než je tělo produkuje. Identifikace zájmového proteinu v součtu všech proteinů je velmi složitý metodologický problém, který zpravidla nelze řešit přímou metodou. Jedním z přístupů k řešení takových problémů, nazývaných peptidomika, je, že suma proteinů je hydrolyzována specifickou proteázou a suma výsledných peptidů je separována kapilární elektroforézou nebo vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC). Konečným cílem je nalézt peptid (peptidy) známé struktury, který je (jsou) a priori fragmentem proteinu kódovaného genomem studovaného organismu. Pokud je takový peptid (peptidy) detekován ve vzorku, dochází se k závěru, že protein je produkován tělem. Metodologické problémy, které při řešení takových problémů vznikají, lze rozdělit do 2 skupin. Prvním problémem je separace směsi, která se obvykle skládá z několika tisíc peptidů. Druhé stanovení struktury izolovaných jednotlivých peptidů. Problém separace je řešen frakcionací primární směsi s následnou separací izolovaných frakcí na jednotlivé složky. Druhý problém řeší především hmotnostní spektrometrické metody, které v konečném důsledku umožňují stanovit molekulové hmotnosti jednotlivých složek (peptidů). Pokud má peptid dostatečně „unikátní“ strukturu (soubor aminokyselin), jako jsou zpravidla dlouhé (více než aminokyselinové zbytky) peptidy, pak bude jeho molekulová hmotnost také „unikátní“ a pravděpodobnost chybná identifikace se stává zanedbatelnou. Vzhledem k tomu, že proces separace peptidů je zaměřen na izolaci peptidu se známou sadou aminokyselin, vyvstává otázka: je možné předpovědět dobu uvolňování takového peptidu z HPLC kolony se znalostí jeho složení aminokyselin? Tento přístup byl poprvé prokázán na počátku 80. let 20. století. Cílem této studie bylo vyvinout techniku ​​pro predikci retenčních objemů peptidů na chromatografu Milichrom A-02 v režimu HPLC s reverzní fází (RP HPLC) za použití mobilní fáze vhodné pro přímé nástřiky do hmotnostního spektrometru. 3

4 2. PŘEHLED LITERATURY 2.1. Peptidy. Aminokyseliny Peptidy jsou biopolymery vytvořené z α-aminokyselinových zbytků spojených peptidovými vazbami (-NH-CO-). Obecný vzorec peptidu lze znázornit takto: NH 2 CH CO NH CH CO... NH CH R 1 R 2 Rn Mezi proteiny a peptidy není jasná hranice, mezi peptidy zpravidla patří biopolymery obsahující maximálně 100 aminokyselinových zbytků. Aminokyseliny jsou jakékoli organické kyseliny, jejichž molekuly obsahují aminoskupinu, často pod tímto názvem znamenají právě α-aminokyseliny, protože. mají velký biologický význam. Molekuly většiny přirozených aminokyselin, které tvoří bílkoviny, mají obecný vzorec H 2 NCH R Jak je patrné ze strukturního vzorce, aminokyseliny (s výjimkou prolinu) se od sebe liší pouze strukturou postranního řetězce R. Aminokyseliny jsou amfoterní sloučeniny, protože jejich molekula obsahuje jak kyselý karboxyl, skupina a základní aminoskupina. V silně kyselém prostředí je karboxylová skupina převážně nedisociovaná, zatímco aminoskupina je protonovaná. V silně alkalickém prostředí je aminoskupina ve formě volné báze a karboxylová skupina je ve formě karboxylátového aniontu. V krystalickém stavu existují aminokyseliny ve formě zwitteriontu, kde je proton z karboxylové skupiny převeden na aminoskupinu. Na biosyntéze přírodních peptidů a proteinů se podílí pouze 20 aminokyselin. Aminokyseliny a jejich vlastnosti jsou uvedeny v tabulce 1. Tabulka 1. Aminokyseliny a jejich vlastnosti. Název aminokyseliny Kód Struktura pk a - -NH 2 -R Glycin G H 2,35 9,78 Alanin A H 3 C 2,35 9,87 Valin V H 3 C CH CH 3 2,29 9,74 4

5 Název aminokyseliny Kód Struktura pk a - -NH 2 -R Leucin LH 3 C CH CH 3 2,33 9,74 Isoleucin IH 3 C * CH CH 3 2,32 9,76 H 2 C Prolin P HC NH 1,95 10,64 Fenylalanin NH3 F.2. 2 2.46 9.41 Tyrosin Y HO CH NH 2 2.20 9.21 10.46 SERINE S HO 2,19 9,21 Threonin T0 * CH CH 3,09 9.10 Cystein C HS 1.92 10.70 8.37 8,37 ASPARTOVNÍ Kyselina D Hooc 1,99 9,90 3,90 3,36 kyseliny glutamové E HOOC 2.10 10.47 4.07 ASPAGINE NH 2 NCO 2,14 8,72 Glutamin QH 2 NCO 2,17 9,13 Lysin KH 2 N 2,16 9,06 10,54 Arginin RH 2 NC NH 1,82 8,99 12,48 NH Histidin HN053 NH91,3MH.

6 Podle charakteru postranních řetězců se aminokyseliny dělí do dvou skupin: aminokyseliny s nepolárními (hydrofobními) alifatickými nebo aromatickými R-skupinami; aminokyseliny s polárními (hydrofilními) R skupinami. Do první skupiny patří 8 aminokyselin: alanin, valin, leucin, isoleucin, methionin, prolin, fenylalanin, tryptofan. Sedm aminokyselin obsahuje v postranním řetězci skupiny, které mohou nést záporný nebo kladný náboj: kyselina asparagová a glutamová při pH 7,0 jsou nabité záporně; lysin, arginin, histidin jsou bazické aminokyseliny, jejichž postranní řetězce mohou být kladně nabité; za alkalických podmínek mohou být vedlejší skupiny tyrosinu a cysteinu peptidů nabity negativně. HPLC separace směsí peptidů je velmi obtížný úkol. V současné době je RP HPLC nejdůležitější metodou pro separaci peptidů. Peptidy jsou polární látky, což zabraňuje jejich interakci s hydrofobním povrchem stacionární fáze a vede k interakci se zbytkovými silanolovými skupinami. Aby se omezila interakce se silanolovými skupinami, přidávají se do eluentu silné kyseliny nebo soli. Aby se snížila polarita peptidů, měla by být chromatografie prováděna při nízkých hodnotách ph (pod 3). Při dodržení těchto zásad se HPLC ukáže jako velmi flexibilní metoda pro separaci peptidů. Je to dáno tím, že tato metoda se vyznačuje vysokou rychlostí separace, reprodukovatelností výsledků a možností analýzy mikrogramových množství látek. Další výhodou RP HPLC je schopnost sbírat frakce v malém objemu těkavých rozpouštědel, což zjednodušuje další hmotnostní spektrometrickou analýzu. Jako těkavá rozpouštědla se zpravidla používá 0,1% kyselina trifluoroctová a mravenčí. Kyselina trifluoroctová je transparentní v UV oblasti do 205 nm, což je velká výhoda při chromatografii komplexních směsí. Kromě toho jsou peptidy vysoce rozpustné v kyselině trifluoroctové. Eluce peptidů z reverzních fází se obvykle provádí v gradientovém režimu s přidáním organického modifikátoru. Nejběžnějším organickým modifikátorem je acetonitril. Je transparentní v UV oblasti do 200 nm a má dobrou selektivitu. 6

7 Dalším důvodem pro široké použití RP HPLC pro analýzu peptidů je schopnost předpovídat jejich chromatografické chování Predikce retenčních objemů a UV spekter peptidů ve složení aminokyselin RP HPLC, poprvé vyjádřeno J. Meekem. Retence peptidů v reverzní fázi je určena hydrofobicitou aminokyselinových zbytků, které tvoří jejich složení. Aminokyseliny s aromatickým nebo velkým alifatickým řetězcem mají hlavní podíl na retenci. Na základě výše uvedeného Meek navrhl vypočítat retenční objemy peptidů na reverzní fázi jako součet příspěvků aminokyselinových zbytků, které tvoří peptid. Navrhl lineární (aditivní) model "zadržování kompozice": VR = V 0 + Z N* + Z C* + Z i (1) kde V R je retenční objem peptidu, v 0 je volný objem kolony; ZN* a ZC*, v daném pořadí, příspěvky volných -NH2 a - nebo modifikovaných koncových skupin peptidu; Z i - příspěvek i-té aminokyseliny (retenční konstanta). Meek chromatografoval 25 peptidů za podmínek RP HPLC gradientu a vyřešením inverzního problému vypočítal retenční konstanty aminokyselin. Korelační koeficienty závislosti V R (vypoč.)=f(v R (exp.)) byly 0,997 (při ph 2,1) a 0,999 (při ph 7,4). I přes vysoké korelační koeficienty je tento model v rozporu s fyzikálním významem, protože takto získané retenční konstanty aminokyselin neodrážejí skutečné rozdíly v jejich hydrofobnosti a některé příspěvky mají záporné hodnoty. Kromě toho existuje mnoho skutečností, podle kterých se s nárůstem počtu aminokyselinových zbytků v peptidu nelineárně zvyšuje povrch jeho hydrofobního kontaktu s reverzní fází, která určuje retenci. Autoři práce také vycházeli z předpokladu, že retenční objemy peptidů jsou vypočteny ze součtu příspěvků aminokyselinových zbytků. Pro výpočet retenčních objemů peptidů navrhli následující model: V R = A* ln (1+ Z j * n j) + B (2) 7

8, kde Zj - empirický retenční parametr, který je vypočten na základě hydrofobnosti aminokyselin; A a B konstanty; nj je počet aminokyselinových zbytků j v peptidu. Tento model poskytuje dobrou korelaci mezi vypočteným a experimentálním retenčním objemem peptidu. Nevýhodou modelu je, že je platný pouze pro konkrétní chromatografický systém (lineární gradient s daným sklonem, fixní průtok, mobilní a stacionární fáze). Použití tohoto modelu je tedy velmi omezené. Autoři této práce proto navrhli další model založený na teorii gradientové eluce, který umožňuje vypočítat retenční objemy peptidů pro širší škálu chromatografických systémů. S ohledem na to, že dostupná plocha hydrofobního kontaktu peptidu se stacionární fází se mění v poměru k jeho molekulové hmotnosti s mocninou 2/3, autoři zvolili funkci pro výpočet retenčních objemů peptidů: VR = f (3) kde a, b, c jsou konstanty závislé na vlastnostech konkrétních chromatografických systémů byly stanoveny experimentálně z chromatografických dat 15 peptidů vybraných pro tento účel. Korelační koeficient závislosti VR (výpočet)=f(vR (exp.)) činil 0,98. Významnou nevýhodou, která omezuje aplikaci této metody, je nutnost vypočítat konstanty a, b a c pro konkrétní chromatografický systém z předběžných experimentů s modelovými peptidy, což je velmi pracný postup. V této práci byly vypočteny retenční objemy a UV spektra peptidů se známou aminokyselinovou sekvencí, přičemž byly předem stanoveny příspěvky aminokyselin k výše uvedeným parametrům. Hodnoty těchto příspěvků byly zjištěny experimentálně z chromatogramů roztoků jednotlivých aminokyselin získaných vícevlnovou fotometrickou detekcí za stejných podmínek, za kterých byly peptidy chromatografovány. Autoři práce navrhli pro výpočet retenčních objemů peptidů následující rovnici: VR = 209 [(Z i) + ZC*+N* + V 0 ] 1/3 990 (4) kde Z i je retenční koeficient aminokyselina "i"; Vo volný objem kolony; Z C*+N* je celková retenční konstanta koncových skupin peptidu. Při výpočtu UV spekter peptidů bylo peptidové spektrum uvažováno jako součet spekter všech jeho strukturních prvků. Chcete-li otestovat navrhovanou metodu, 8

9, 30 peptidů bylo chromatografováno a korelační koeficient mezi vypočteným a experimentálně zjištěným retenčním objemem byl 0,95. Navržená metoda pro výpočet UV spekter peptidů má také uspokojivou prediktivní schopnost. V uvažované práci byly jako eluenty použity acetonitril a vodný roztok chloristanu lithného (0,2 M LiCLO M HClO 4 ), což je netěkavá látka, což velmi ztěžuje následnou hmotnostní spektrometrickou identifikaci peptidů. Proto se nám zdálo vhodné vyvinout metodu využívající mobilní fázi o složení acetonitril - kyselina trifluoroctová, jejíž všechny složky jsou těkavé látky a neruší hmotnostní spektrometrickou analýzu. 9

10 3. EXPERIMENTÁLNÍ HPLC byla provedena na chromatografu Milichrom A-02 na koloně 2x75 mm s fází ProntoSIL C 18 AQ (Bischoff Analysentechnik und Geräte GmbH, Německo) za následujících podmínek: eluent A: 0,01 M kyselina trifluoroctová; eluent B: acetonitril; lineární gradient: 40 min od 5 do 100 % B; průtok: 100 ul/min; teplota kolony: 40 °C; detekce: při 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280 a 300 nm, t = 0,18 s; objem vzorku: 4 µl. Roztok pro testování chromatografického systému: KBr - 0,2 mg/ml; uridin - 0,2 mg/ml; kofein - 1 mg/ml; m-nitroanilin - 0,1 mg/ml; o-nitroanilin - 0,1 mg/ml; rozpouštědlo 2% acetonitril ve vodě. Všechna činidla s hmotnostním zlomkem hlavní látky nejméně 98 %. V práci byly použity aminokyseliny (Serva, Německo), acetonitril stupně 0 (SPF Kriokhrom, St. Petersburg) a bezvodá kyselina trifluoroctová (ICN Biomedicals, USA). Vzorky peptidů laskavě poskytl V.V. Samukov (NPO Vector, Novosibirsk) a I.V. Nazimov (IBCh RAS, Moskva). Koncentrace aminokyselin v chromatografických roztocích byly 0,2-1 mg/ml, peptidů 0,1-2 mg/ml. Chromatogramy byly zpracovány pomocí programu Multichrom (CJSC Ampersend, Moskva). Pro výpočet VR, ploch chromatografických píků při detekci při 8 vlnových délkách (S λ) a grafické znázornění peptidových chromatogramů byl použit program Khrom P (CJSC Institute of Chromatography EkoNova, Novosibirsk). Linearizace křivky znázorněné na obrázku 1 byla provedena pomocí programu Microsoft Excel (Microsoft Corporation,). 10

11 4. VÝSLEDKY A DISKUSE 4.1. Kontrola stability chromatografického systému Kontrola stability chromatografického systému byla provedena za použití postupu regulovaného touto metodou. Testovaný roztok byl chromatografován a z výsledných chromatogramů bylo vypočteno 14 parametrů, z nichž každý řídí určitý indikátor chromatografického systému: VR bromidového iontu, volný objem kolony; spektrální poměr S 280 /S 250 přesnost ladění uridinového detektoru v rozsahu od 250 do 280 nm; spektrální poměr S 260 /S 280 kofeinový lineární rozsah detektoru; spektrální poměr S 260 /S 230 m-nitroanilinu vhodnost eluentu A. Pík o-nitroanilinu byl použit ke kontrole: VR odchylka gradientu od daného tvaru, spektrální poměry přesnost ladění detektoru v rozsahu od 210 do 300 nm, asymetrie píku A 10% porušení v náplni kolony, přesnost dávkování vzorku S 210. Periodické měření chromatografických a spektrálních parametrů modelového roztoku nám umožnilo ověřit reprodukovatelnost použitého chromatografického systému. Výsledky testu jsou uvedeny v tabulce 2. Tabulka 2. Výsledky testu chromatografického systému, n = 8. Látka Parametr 11 Průměrná hodnota parametru S r (%) Bromid VR, μl 148 1,0 Uridin S 280 /S 250 0,53 1,3 Kofein S 260 /S 280 0,73 0,6 m-nitroanilin S 260 /S 230 0,80 1,0 o-nitroanilin VR, μl, 6 S 220 /S 210 1,71 0,5 S 230 /S 210 1,07 S 0,02 61 61 210 0,58 0,9 S 250 /S 210 0,40 1,4 S 280 /S 210 0,59 0,9 S 300 /S 210 0,32 1,2 A 10% 1,05 1,1 Výstupní signál (210 p.o.) Sr. µl 25,00 1.4

12 Získané hodnoty S r umožňují konstatovat, že popsaný chromatografický systém je stabilní Výpočet retenčních objemů peptidů Výchozí chromatografická data potřebná pro výpočet retenčních koeficientů aminokyselin byla získána z chromatogramů těchto aminokyselin. a peptidy GG a GGG za podmínek uvedených v části 3. Retenční koeficienty aminokyselin vypočtené podle rovnice: Z i = V Ri V 0 ZC*+N* (5) kde V Ri je retenční objem aminokyseliny " i"; Vo volný objem kolony (retenční objem Br-, v tomto chromatografickém systému byl 148 ul.); Z C+N je celková retenční konstanta koncových skupin peptidu. Z C+N bylo vypočteno podle rovnice: ZC*+N* = VR (G) V 0 ((6) kde VR (G) je retenční objem glycinu, μl; VR (GGG) a v R (GG ) jsou retenční objemy peptidů GGG a GG , µl Součet retenčních faktorů koncových skupin [(-NH 2) + (-CONH 2)] byl považován za rovný součtu retenčních faktorů skupin [( -NH 2) + (-)] Chromatografická data a vypočtené retenční konstanty strukturních prvků peptidů jsou uvedeny v tabulce 3. Tabulka 3. Retenční objemy aminokyselin a peptidů GG a GGG Retenční konstanty strukturních prvků peptidů Kód VR, µl Z i, µl Kód VR, µl Z i, µl NPSVGMQYDIHLTFEWK GG C GGG A (C*+N*) konec - 25R

13 Lineární model „retenční složení“ Pro predikci retenčních objemů peptidů v rámci lineárního modelu navrženého v práci jsme vypočítali retenční objemy 28 peptidů (tab. 4) a porovnali získaná data s experimentálně zjištěnými daty (obr. 1). Tabulka 4. Experimentálně zjištěné a vypočítané retenční objemy peptidů (lineární model). Peptid VR (exp.) L VR (vyp.), L 1 GG GGG AS GRGDS TKPR WAGGDASGE GL MY KPVGKKRRPVKVYP WD-YGGDASGE WD-AGGDA NCMLDY SYSMEHFRWG WD-VGGDASGE YGGFLRKYPK RPPGFSPFR MEHFRWG RVYIHPF YGGFLRRIRPKLK YGGFM DRVYIHPF QATVGDINTERPGMLDFTGK ELYENKRPRRPYIL DRVYIHPFHL YD-AGFL RPKPQQFFGLM - NH PQQFFGLM-NH GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH

14 V VR R (vypočteno), ul VR (exp.), R ul 1. Porovnání experimentálně zjištěných a vypočtených retenčních objemů peptidů. Výpočet hodnot V R byl proveden podle rovnice (1). Jak je patrné ze získaných dat, lineární model poskytuje uspokojivé výsledky pouze pro relativně hydrofilní peptidy; pro hydrofobní peptidy se vypočítané hodnoty ukázaly být znatelně vyšší než experimentální. Podobné výsledky byly získány i v práci. 1 dává rovnici: V R = 173 [(n Z i) + V 0 ] 1/3 785

15 VR (vypoč.), µl VR VR (exp.), µl VR 2. Porovnání experimentálně zjištěných a vypočtených retenčních objemů peptidu. Hodnoty VR byly vypočteny podle rovnice (7). 15

16 Tabulka 5. Experimentálně zjištěné a vypočtené retenční objemy peptidů (nelineární model). Peptid VR (exp.) L VR (vyp.), L 1 GG GGG AS GRGDS TKPR WAGGDASGE GL MY KPVGKKRRPVKVYP WD-YGGDASGE WD-AGGDA NCMLDY SYSMEHFRWG WD-VGGDASGE YGGFLRKYPK RPPGFSPFR MEHFRWG RVYIHPF YGGFLRRIRPKLK YGGFM DRVYIHPF QATVGDINTERPGMLDFTGK ELYENKRPRRPYIL DRVYIHPFHL YD-AGFL RPKPQQFFGLM - NH PQQFFGLM-NH GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH Korelační koeficient závislosti VR (kalkul.)=f(v R (exp.)) byl 0,96. V příloze jsou uvedeny experimentální a vypočtené chromatogramy modelové směsi 11 peptidů. šestnáct

17 4.3. Výpočet UV spekter peptidů Specifické spektrální koeficienty strukturních prvků peptidů byly převzaty z v našem chromatografickém systému brání správnému výpočtu spektrálních poměrů systémové píky, stejně jako slabá retence hydrofilních aminokyselin a krátkých peptidů. Hodnoty specifických spektrálních koeficientů jsou uvedeny v tabulce 6. Tabulka 6. Spektrální koeficienty strukturních prvků peptidů absorbujících UV jako plochy chromatografických píku při C=1 mm a objemu vzorku 4 μl, (e.o.p. μl) . λ, nm W F Y H C M R Q N E D N*+C* PS Spektrální charakteristiky peptidů jako plochy jejich chromatografických píku při С=1 mM a objem vzorku 4 ul byly vypočteny podle rovnice: a λ peptid = a λ N*+C* + (m-1) a λ λ PS + ai (9) kde m je celkový počet aminokyselinových zbytků v peptidu, a λN*+C* je podmíněná plocha píku koncových skupin peptidu a λPS je specifická absorpce peptidová vazba na vlnové délce λ vlnové délky λ, ai jsou spektrální charakteristiky zbytků aminokyselin pro vlnovou délku λ. Množství obsažená v rovnici (9) byla získána následovně. Specifické spektrální charakteristiky strukturních prvků peptidů při vlnové délce λ=210 nm (a 210 i) byly vypočteny jako plochy jejich chromatografických píku pro roztok o koncentraci 1 mM a objemu vzorku 4 μl dle k rovnici: a210i = a 210 AA a 210 N*+C*, (10) kde plocha píku aminokyseliny 210 AA; 210 N*+C* podmíněná plocha píku koncových skupin peptidu. Hodnota a 210 N*+C* byla vzata rovna 210 Leu, protože NH2 skupiny jsou jediné Leu chromofory v rozsahu vlnových délek nm. 17

18 Specifická absorpce peptidové vazby (a 210 PS) byla vypočtena jako rozdíl mezi specifickými absorpcemi peptidů GGG a GG: a 210 PS = a GGG a GG (11) Spektrální charakteristiky pro vlnovou délku λ byly vypočteny pomocí rovnice: a λ i = a 210 i (S λ /S 210), (12) kde S λ /S 210 jsou spektrální poměry aminokyselin a peptidů GG a GGG, což jsou poměry ploch píků na vlnových délkách λ do oblasti píku při λ = 210 nm. Tabulka 7 porovnává vypočítané spektrální poměry SX/S210 pro 28 peptidů s těmi, které byly získány experimentálně. Experimentálně získané a vypočítané spektrální poměry peptidů jsou ve vzájemné poměrně dobré shodě. Ve většině případů nejsou rozdíly větší než 0,06. U některých peptidů (5, 9, 12, 16, 18, 22, 23, 26, 27) jsou patrnější rozdíly mezi předpokládanými a experimentálními spektrálními poměry. Důvody těchto rozdílů vyžadují další výzkum. Tabulka 7. Srovnání experimentálních a vypočtených spektrálních poměrů peptidů. Hodnota peptidu Spektrální poměry S λ /S 210 pro vlnové délky λ(nm):

19 Hodnota peptidu Spektrální poměry S λ /S 210 pro vlnové délky λ(nm): Calc Exp Calc Exp

20 Hodnota peptidu Spektrální poměry S λ /S 210 pro vlnové délky λ(nm): Calc Exp Calc Exp Ze získaných dat je vidět, že popsaná metoda výpočtu retenčních objemů peptidů známého složení a jejich UV spekter za podmínek gradientová RP HPLC má uspokojivou prediktivní schopnost a může být užitečná ve výzkumu souvisejícím se separací směsí peptidů. dvacet

21 5. ZÁVĚRY 1. Byla vyvinuta metoda, která umožňuje predikovat retenční objemy peptidů známého složení v gradientovém RP HPLC módu na chromatografu Milichrome A-02 za použití těkavé mobilní fáze vhodné pro přímé vstřikování izolovaných frakce do hmotnostního spektrometru. 2. Byla vyvinuta metoda pro výpočet optické absorpce peptidů při vlnových délkách 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280 a 300 nm přímo v mobilní fázi používané k separaci peptidů. 3. Vyvinuté metody byly testovány pro 28 modelových peptidů. Korelační koeficient vypočtených retenčních objemů s odpovídajícími experimentálními hodnotami byl 0,96. Nesoulad mezi vypočtenými a experimentálně získanými spektrálními poměry S λ / S 210 nebyl větší než 0. LITERATURA 1. Reznikov VA, Shteingarts VD. Aminokyseliny. Novosibirsk: NGU, S. Dawson R., Elliot D., Elliot W., Jones K. Biochemist's Handbook. Moskva: Mir, s. 3. Ovčinnikov Yu.A. Bioorganická chemie. Moskva: Vzdělávání, s. 4. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie v biochemii (ed. Henshen A.). Moskva: Mir, s. 5 Meek J.L. //Proc. Natl. Akad. sci. USA. 1980, V. 77. č.3. P Sakamoto Y., Kawakami N., Sasagawa T. // J. Chromatogr V P Sasagawa T., Okuyama T., Teller D.C. // J. Chromatogr VP Browne C.A., Bennet H.P.J., Solomon S. // Anal. Biochem V.124. P Meek J.L., Rossetti Z.L. // J. Chromatogr V P Azarova I.N., Baram G.I., Goldberg E.L. // Bioorganická chemie. V tisku. 11. Hmotnostní koncentrace látek absorbujících UV záření. Postup měření vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií. FR Irkutsk

22 7. Příloha Experimentální (A) a vypočtený (B) chromatogram směsi 11 peptidů. Počty peptidů podle tabulky A 0,5 u.o.p nm B nm Objem, ul

MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ A VĚDY RUSKÉ FEDERACE FEDERÁLNÍ AGENTURA PRO VZDĚLÁVÁNÍ STÁTNÍ UNIVERZITA V NOVOSIBIRSKÉMU FAKULTA Přírodovědecké fakulty Katedra: Analytická chemie Diplomová práce

Přednáška 1: Primární struktura proteinů - aminokyseliny 1 Diverzita proteinů Mnoho biologických funkcí těla je zajišťováno proteiny. Tyto funkce zahrnují transport a skladování kyslíku (hemoglobin

SEPARACE ENANTIOMERNÍCH DERIVÁTŮ AMINOKYSELIN NA AMINOVANÉM β-cyklodextrinu VYSOCE ÚČINNOU KAPALINOU CHROMATOGRAFIE IA Anan'eva, E. N. Shapovalova, S. A. Lopatin, O.

1. Kovalentní vazby v proteinech a enzymech. Dát příklad. VSTUPENKA 1 2. Co je základem pro separaci bílkovin frakcionací za přítomnosti různých koncentrací solí. Z jakých nečistot tato metoda umožňuje

Téma 23. Aminy. Aminokyseliny a peptidy Obsah tématu: Aminy, jejich klasifikace a nomenklatura. Způsoby, jak získat a Chemické vlastnosti aminy. Anilin, jeho elektronická struktura. Závislost na hlavních vlastnostech

T.P. Vavilová A.E. Medveděv Biologická chemie Biochemie dutiny ústní Učebnice Ministerstvo školství a vědy Ruské federace Doporučeno První moskevskou státní lékařskou univerzitou pojmenovanou po

Moskevský institut fyziky a technologie (Státní univerzita) Katedra molekulární a biologické fyziky Metody fyzikálního výzkumu Přednáška 9 Kapalinová chromatografie Metody a technologie

MINISTERSTVO ZDRAVÍ RUSKÉ FEDERACE LÉKÁRNICTVÍ Indapamid FS.2.1.0017.15 Indapamid Indapamidum Místo FS 42-0303-08 N-[(2RS)-2-Methyl-2,3-dihydro-1H-indol -3-sulfamoyl-4-chlorbenzamid

AMINOKYSELINY. PEPTIDY. PROTEINY Aminokyseliny se nazývají karboxylové kyseliny, v jejichž uhlovodíkovém radikálu je jeden nebo více atomů vodíku nahrazeno aminoskupinami. V závislosti na relativní poloze

BIOCHEMIE Editoval člen korespondent Ruské akademie věd, profesor E.S. SEVERINA 5. vydání, přepracovaná a doplněná Učebnice doporučená Výchovným a metodickým sdružením pro lékařství a farmacii

1 Aminokyseliny a proteiny Struktura, vlastnosti Spirály se nacházejí v mnoha oblastech: v architektuře, v makromolekulách proteinů, nukleových kyselinách a dokonce i v polysacharidech (Loretto hapel, Santa Fe, NM / Sarbo)

MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ A VĚDY RUSKA Federální státní autonomní vzdělávací instituce vysokého školství "NOVOSIBIRSK NÁRODNÍ VÝZKUMNÁ STÁTNÍ UNIVERZITA" Fakulta přírodních věd

APP NOTE-16/2016LC Analytické možnosti kapalinového chromatografu Maestro HPLC s nízkoteplotním odpařovacím detektorem rozptylu světla MAESTRO ELSD na příkladu stanovení aminokyselin v hydrolyzátu

8. Otázky 1. Definujte chromatografii. 2. Jaké vlastnosti chromatografie umožňují dosáhnout lepší separace látek s podobnými vlastnostmi ve srovnání s jinými separačními metodami. 3. Seznam

MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ A VĚDY R.F.

1 Vlastnosti struktury, reaktivity a metody syntézy aminokyselin. Proteiny Sloučenina, která obsahuje jak kyselou funkční skupinu, tak aminoskupinu, je aminokyselina. Acidobazická

Výhody kolon Agilent AdvanceBio SEC SEC pro biofarmaceutické analýzy Porovnání kolon od různých dodavatelů pro zlepšení kvality dat Technický přehled

Tovární laboratoř. Diagnostika materiálů» 4. 2007. Ročník 73 23 STANOVENÍ AMINOKYSELIN V LÉKÁCH POMOCÍ HPLC na reverzní fázi s ampérometrickou detekcí M. G.

UDC 615.22.074: 543.544.5.068.7.062 VALIDACE METOD KVANTITATIVNÍHO STANOVENÍ TRIMETAZIDIN DIHYDROCHLORIDU V TABLETECH 0,02 g E. V. Kompantseva, G. A. G. A. G. G. Martirosova Státní univerzita P. Martirosova

MODERNÍ PREPARATIVNÍ BLESKOVÁ CHROMATOGRAFIE Část 2* A.Abolin, Ph.D., "GalaChem" [e-mail chráněný] P.-F. Ikar, Interchim (Francie) Pokračujeme ve vydávání materiálů o moderních metodách preparace

Dodatek k certifikátu 44071 list 1 o schválení typu měřidla

STÁTNÍ STANDARD RUSKÉHO VÝCHODOSIBIŘSKÉHO VĚDECKÉHO VÝZKUMNÉHO ÚSTAVU FYZIKÁLNĚ-TECHNICKÁ A RÁDIOVÁ MĚŘENÍ CERTIFIKÁT MVI 02-2002 Metodika atestace pro měření hromadné koncentrace

ODDÍL 1 STANOVENÍ EVOLUČNÍ VZDÁLENOSTI A RYCHLOSTÍ EVOLUCE AMINOKYSELINOVÝCH SEKVENCÍ 1.1. TEORETICKÝ ZÁKLAD Evoluční průměr mezi aminokyselinovými sekvencemi (p, d).

01/2016:20255 2.2.55. PEPTIDOVÉ MAPOVÁNÍ Peptidové mapování je metoda pro identifikaci proteinů, zejména těch, které byly získány rekombinantní DNA. Způsob zahrnuje chemické nebo enzymatické

Ministerstvo školství a vědy Ruská Federace FEDERÁLNÍ STÁTNÍ ROZPOČTOVÉ VZDĚLÁVACÍ INSTITUCE VYSOKÉHO ŠKOLSTVÍ "SARATOV NÁRODNÍ VÝZKUMNÁ STÁTNÍ UNIVERZITA

Konformace proteinů: principy vzniku 1. Vazby určující konformaci molekul proteinů kovalentní vazby: peptidový disulfid nekovalentní interakce: iontové interakce vodíková vazba

FEDERÁLNÍ AGENTURA PRO VZDĚLÁVÁNÍ Státní vzdělávací instituce vyššího odborného vzdělávání „Uralská státní univerzita. DOPOLEDNE. Gorky" IONTS "Ekologie a management přírody"

MINISTERSTVO ZDRAVÍ RUSKÉ FEDERACE FARMAKOPICKÝ ČLÁNEK Ketorolac trometamol FS.2.1.0022.15 Ketorolac trometamol Ketorolacum trometamolum Místo SP XII, část 1, FS 42-0242-07,3dihydro-1RS) - pyrrolysin-karboxylát

Moskevský institut fyziky a technologie (Státní univerzita) Katedra molekulární a biologické fyziky Fyzikální metody výzkumu Přednáška 8 Detektory v chromatografii Kapalinová chromatografie

MINISTERSTVO ZDRAVÍ RUSKÉ FEDERACE FARMAKOPICKÝ ČLÁNEK Meloxicam FS.2.1.0025.15 Meloxicam Meloxicamum Místo GF XII, část 1, FS 42-0254-07 4-Hydroxy-2-methyl-(5-thiazol-1,3,3 -2-yl)-l,l-dioxo-lA

NÁRODNÍ AKADEMIE VĚD BĚLORUSKA RUE "VĚDECKÉ A PRAKTICKÉ CENTRUM NÁRODNÍ AKADEMIE VĚD BĚLORUSKA PRO POTRAVINÁŘSTVÍ" INOVATIVNÍ TECHNOLOGIE V POTRAVINÁŘSKÉM PRŮMYSLU Materiály Mezinárodní vědecké a praktické konference XI

OBECNÝ POPIS PRÁCE Relevantnost práce V současné době je metoda vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) široce používána k identifikaci a stanovení obsahu komplexních organických látek.

Validace analytických metod: praktická aplikace. Pisarev V.V., Ph.D., MBA, zástupce generálního ředitele federálního státního unitárního podniku „Státní výzkumné centrum pro antibiotika“, Moskva (www.pisarev.ru) Úvod

2.2.29. VYSOCE ÚČINNÁ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE Vysoce výkonná kapalinová chromatografie (HPLC) je separační technika založená na rozdílné distribuci látek mezi dvěma nemísitelnými látkami.

MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ A VĚDY RUSKA NÁRODNÍ VÝZKUM STÁTNÍ UNIVERZITA TOMSK FAKULTA CHEMICKÁ Anotovaný pracovní program oboru Chromatografické metody analýzy Studijní obor

Použití produktů Agilent Bond Elut Plexa ke snížení iontové suprese a zlepšení citlivosti LCMS Pokyny pro léčiva

MINISTERSTVO ZDRAVÍ RUSKÉ FEDERACE FARMAKOPICKÝ ČLÁNEK Karbamazepin FS.2.1.0020.15 Karbamazepin Místo FS 42-2803-96; Karbamazepinum místo GF XII, část 1, FS 42-0240-07 5H-Dibenzazepin-5-karboxamid

Přednáška 22 Aminokyseliny. Protein Work je nejlepší způsob, jak si užívat života. I. Kantova nomenklatura aminokyselin. přírodní aminokyseliny. Chiralita aminokyselin, které tvoří proteiny. acidobazické vlastnosti,

APP NOTE-10/2016LC Analytické možnosti kapalinového chromatografu Maestro HPLC s detektorem diodového pole a fotometrickým detektorem s pevnými vlnovými délkami (LED) na příkladu stanovení

Chemie Přednáška 3 α-aminokyseliny, peptidy, proteiny. Přednášku vede prof. Belavin Ivan Yurievich 2. α-aminokyseliny, peptidy, proteiny α-aminokyseliny proteiny bioregulátory zdroj energie α-aminokyseliny heterofunkční

Laboratorní práce 11. MECHANISMY HLAVNÍCH MOLEKULÁRNĚ-GENETICKÝCH PROCESŮ Účel lekce: seznámit se se složením DNA a RNA, procesy replikace, transkripce a translace na příkladu řešení typických

APP NOTE-34/2018LC Analytické možnosti kapalinového chromatografu Maestro HPLC s detektorem diodového pole na příkladu stanovení obsahu fenolických a furanových sloučenin v koňacích dle

Testování nečistot u kombinovaných léků s fixní dávkou pomocí analyzátoru nečistot Agilent 129 Infinity II HDR-DAD

APP NOTE-18/2017LC Analytické možnosti kapalinového chromatografu Maestro HPLC s amperometrickým detektorem na příkladu stanovení katecholaminů v krevní plazmě Yashin A. Ya. k. x. PhD, přední inženýr

GOST R 51435-99 Jablečná šťáva, koncentrovaná jablečná šťáva a nápoje obsahující jablečnou šťávu. Metoda stanovení obsahu patulinu pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie. OKS 67.160.20

POSOUZENÍ OFICIÁLNÍHO Oponenta dizertační práce Michaila Vadimoviče Šaškova „Výzkum vysoce polárních stacionárních kapalných fází na bázi iontových kapalin pro kapilární plynovou chromatografii“ pro soutěž

PEPTIDY přírodní nebo syntetické. komp., molekuly to-rykh jsou sestaveny ze zbytků a-aminokyselin propojených peptidovými (amidovými) vazbami C (O) NH. Mohou také obsahovat neaminokyselinovou složku v molekule (např. sacharidový zbytek). Podle počtu aminokyselinových zbytků obsažených v molekulách peptidu se rozlišují dipeptidy, tripeptidy, tetrapeptidy atd. Peptidy obsahující až 10 aminokyselinových zbytků, tzv. oligopeptidy obsahující více než 10 aminokyselinových zbytků polypeptidy Prir polypeptidy s mol. m. více než 6 tisíc naz. proteiny

Odkaz na historii. Peptidy byly nejprve izolovány z enzymatických proteinových hydrolyzátů. Termín "peptidy" navrhl E. Fisher. První syntetický peptid získal T. Curtius v roce 1881 E. Fisher v roce 1905 vyvinul první obecná metoda syntézou peptidů a syntetizoval řadu oligopeptidů dekomp. budov. stvoření. Studenti E. Fischera E. Abdergalden, G. Leike a M. Bergman přispěli k rozvoji chemie peptidů. V roce 1932 použili M. Bergman a L. Zervas benzyloxykarbonylovou skupinu (karbobenoxy skupinu) při syntéze peptidů k ​​ochraně a-aminoskupin aminokyselin, což znamenalo novou etapu ve vývoji syntézy peptidů. Výsledné N-chráněné aminokyseliny (N-karbobenoxyaminokyseliny) byly široce používány k získání různých peptidů, které byly úspěšně použity ke studiu řady klíčových problémů v chemii a biochemii těchto B-B, například ke studiu substrátu specifičnost proteolytických. enzymy. S použitím N-karbobenoxyaminokyselin byly poprvé syntetizovány přírodní peptidy (glutathion, karnosin aj.). Důležitý úspěch v této oblasti se vyvinul na začátku. 50. léta P. Vaughan et al. syntéza peptidů metodou směsného anhydridu (způsoby syntézy peptidů jsou podrobně diskutovány níže). V. Du Vigno v roce 1953 syntetizoval první peptidový hormon oxytocin. Na základě konceptu vyvinutého P. Merrifieldem v roce 1963 byl koncept syntézy peptidů v pevné fázi vytvořen automaticky. syntetizátory peptidů. Intenzivně se vyvíjejí metody pro řízenou enzymatickou syntézu peptidů. Použití nových metod umožnilo syntetizovat hormon inzulín atd.

Syntetický úspěch. peptidová chemie byla připravena pokrokem ve vývoji takových metod pro separaci, čištění a analýzu peptidů, jako je iontoměničová chromatografie, elektroforéza pro rozklad. média, gelová filtrace, vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC), imunochem. Analýza, atd. Metody analýzy koncových skupin a metody postupného štěpení peptidů také prošly velkým rozvojem. Byly vytvořeny zejména automatické. analyzátory aminokyselin a automat přístroje pro stanovení primární struktury peptidů – tzv. sekvencery.

Názvosloví peptidů. Aminokyselinový zbytek peptidů, nesoucí volné. a-aminoskupina, tzv. N-terminál a nosič je volný. a-karboxylová skupina - C-konec. Název peptidupochází z názvu. aminokyselinové zbytky obsažené v jeho složení, uvedené sekvenčně, počínaje N-koncem. V tomto případě se používají triviální názvy. aminokyseliny, ve kterých je koncovka "in" nahrazena "silt"; výjimka C-koncový zbytek, tzv. to-rogo se shoduje s názvem. odpovídající aminokyselinu. Všechny aminokyselinové zbytky zahrnuté v peptidech jsou číslovány počínaje N-koncem. Pro zaznamenání primární struktury peptidů (sekvence aminokyselin) se široce používá třípísmenné a jednopísmenné označení aminokyselinových zbytků (například Ala Ser-Asp Phe-GIy alanyl-seryl-asparagyl-fenylalanyl-glycin).

Struktura. Peptidová vazba má St. Islands částečně dvojnou vazbu. To se projevuje zkrácením délky této vazby (0,132 nm) oproti délce jednoduché vazby C N (0,147 nm). Částečně dvojitě propojená povaha peptidové vazby znemožňuje uvolnění. rotace substituentů kolem něj. proto je peptidová skupina planární a obvykle má trans-konfiguraci (forma I). T. arr., páteř peptidového řetězce je řada tuhých rovin s pohyblivým („kloubovým“) kloubem v místě, kde se nacházejí asymetrické. atomy C (ve f-le I jsou označeny hvězdičkou).

V roztocích peptidů je pozorována přednostní tvorba určitých konformerů. Při prodlužování řetězce výraznější stabilitu získávají (podobně jako u proteinů) uspořádané prvky sekundární struktury (a-helix a b-struktura). Tvorba sekundární struktury je zvláště typická pro běžné peptidy, zejména pro polyaminokyseliny.

Vlastnosti. Oligopeptidy jsou blízké aminokyselinám v St., polypeptidy jsou podobné proteinům. Oligopeptidy jsou obvykle krystalické. in-va, rozkládající se při zatížení. do 200 300 0 C. Jsou dobře sol. ve vodě, razb. to-max a alkálie, téměř žádný sol. v org. r-strážci. Výjimka Oligopeptidy postavené z hydrofobních aminokyselinových zbytků.

Oligopeptidy mají amfoterní vlastnosti a v závislosti na kyselosti média mohou existovat ve formě kationtů, aniontů nebo zwitteriontů. Hlavní absorpční pásy v IR spektru pro NH skupinu 3300 a 3080 cm-1, pro C=O skupinu 1660 cm-1. V UV spektru je absorpční pás peptidové skupiny v oblasti 180-230 nm. Izoelektrický bod (pI) peptidů se široce mění a závisí na složení aminokyselinových zbytků v molekule. Hodnoty pKa peptidů jsou pro a-COOH cca. 3, pro -NH2 cca. osm.

Chem. Svaté ostrovy oligopeptidů jsou určeny funkcemi v nich obsaženými. skupiny, stejně jako vlastnosti peptidové vazby. Jejich chem. přeměna ve význam. nejméně podobné odpovídajícím p-tionům aminokyselin. Dávají pozitivní. biuretové reakce a ninhydrinové reakce. Dipeptidy a jejich deriváty (zejména estery) se snadno cyklizují na diketopiperaziny. Při akci 5,7 n.

Hydrochloric to-you peptidy jsou hydrolyzovány na aminokyseliny během 24 hodin při 105 0 C.

Syntéza. Chem. syntéza peptidů spočívá ve vytvoření peptidové vazby mezi skupinou COOH jedné aminokyseliny a skupinou NH 2 jiné aminokyseliny nebo peptidu. V souladu s tím se rozlišují karboxylové a aminové složky p-tionu syntézy peptidů. K provedení cílené řízené syntézy peptidů je nutné předběžně. dočasná ochrana všech (nebo některých) funkcí. skupiny, to-žito se nepodílejí na tvorbě peptidové vazby, stejně jako předběžné. aktivace jedné ze složek syntézy peptidů. Po skončení syntézy se chránící skupiny odstraní. Při získávání biologicky aktivních peptidů je nezbytnou podmínkou zamezení racemizace aminokyselin ve všech fázích syntézy peptidů.

Naíb. důležitými metodami pro tvorbu peptidové vazby při realizaci okresu v p-re metodách aktivace. estery, karbodiimid, směsné anhydridy a azidová metoda.

Metoda aktivovaného esteru je založena na pre- vytvoření esterového derivátu karboxylové složky zavedením alkoholového zbytku obsahujícího silný substituent přitahující elektrony. V důsledku toho vzniká vysoce reaktivní ester, který snadno podléhá aminolýze působením aminosložky syntézy peptidů. jako aktivátor. estery při syntéze peptidů jsou široce používány pentafluor-, pentachlor-, trichlor- a p-nitrofenyl a řada dalších esterů chráněných aminokyselin a peptidů.

Karbodiimidová metoda pro tvorbu peptidové vazby zahrnuje použití rozkladu jako kondenzačních činidel. substituované karbodiimidy. Zvláště rozšířené použití při syntéze peptidů získal dicyklohexylkarbodiimid:

X a Y resp. N- a C-ochranné skupiny S tímto kondenzačním činidlem může být peptidová syntéza prováděna také ve vodném médiu, protože rychlosti p-iontů hydrolýzy a aminolýzy intermediárně vytvořené O-acylisomočoviny (II) se významně liší. Při syntéze peptidů se také používají dekomp. ve vodě rozpustné karbodiimidy (např. N-dimethylaminopropyl-N"-ethylkarbodiimid).

Metoda směsného anhydridu je založena na předběžné aktivace karboxylové složky syntézy peptidů tvorbou směsného anhydridu s karboxylovou nebo inorg. k tomu. Naíb. často k vám používají alkylestery chloromravenčí (chloruhličité), zejména ethyl a isobutylethery, například:

B - terciární amin

Při syntéze peptidů touto metodou jsou velmi účinné směsné anhydridy N-acylaminokyselin a pivalové (trimethyloctové) to-you. Díky silnému putu. k indukčnímu účinku terc-butylové skupiny je elektrofilita karboxylového atomu C ve zbytku kyseliny pivalové významně snížena, a to spolu se stérickou. překážky, potlačuje nežádoucí. postranní okrsek tvorby uretanu a volný. N-acylaminokyseliny, hrany se provádějí podle schématu:

V jedné verzi metody směsného anhydridu se jako kondenzační činidlo používá 1-ethoxykarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydrochinolin. Toto je Comm. snadno tvoří meziprodukt s karboxylovou složkou syntézy peptidů. směsný anhydrid, který rychle vstupuje do kondenzační oblasti, a nežádoucí je zcela vyloučen. vedlejší okres.

Speciálním případem metody směsného anhydridu je metoda symetrická. anhydridy, v Krom se používají anhydridy aminokyselin 2 O. Jejich použití eliminuje možnost disproporcionace nebo nesprávné aminolýzy.

Azidová metoda syntézy zahrnuje aktivaci karboxylové složky jejím převedením na azid N-substituované aminokyseliny nebo peptidu:

Vzhledem k nestabilitě jejich azidů ve volném. forma z roztoku se zpravidla neizoluje. Pokud se místo dusitanů alkalických kovů pro p-tion s hydrazidem použijí alkylestery dusíkatých látek (např. terc-butylnitrit), pak lze kondenzaci azidu provést v org. r-rozpouštědlo; výsledný HN3 je vázán s terciárními aminy. Často je kondenzace azidů nežádoucím způsobem komplikovaná. postranní p-tiony (přeměna hydrazidu ne na azid, ale na amid; p-tionhydrazid s azidem, což vede k tvorbě 1,2-diacyl-hydrazinu; int. vznik isokyanátu, který v důsledku Curtiova přesmyku může vést k derivátu močoviny nebo odpovídajícího uretanu atd.). Výhodou azidové metody je nízký stupeň racemizace, možnost použití serinu a threoninu bez ochrany hydroxylových skupin.

Pro konverzi chráněné peptidy ve speciálech pro volné použití. způsoby uvolňování, to-žito na bázi p-tionů, zajišťující štěpení dekomp. ochranné skupiny, které zaručují zachování všech peptidových vazeb v molekule. Příklady deblokování: odstranění benzyloxykarbonylové skupiny katalyzátoru hydrogenolýza při atm. tlaku a teplotě místnosti, odštěpení terc-butyloxykarbonylové skupiny mírnou acidolýzou, stejně jako hydrolytické. odštěpení trifluoracetylové skupiny působením zřed. řešení základů.

Při syntéze biologicky aktivních peptidů je důležité, aby nedocházelo k racemizaci, ke které může dojít v důsledku reverzibilního štěpení H+ z a -C atomu N-acylaminokyseliny nebo peptidu. Racemizace je podporována základnami a vám, vysoká teplota a polární řešení. Rozhodující roli hraje racemizace katalyzovaná zásadami, která může probíhat podle tkzv. azlaktonovým mechanismem nebo enolizací podle schématu:

Naíb. důležité způsoby vyloučení racemizace: 1) prodloužení peptidového řetězce ve směru od C-konce k N-koncipomocí N-ochranných skupin typu ROC(O). 2) Aktivace N-chráněných peptidových fragmentů C-koncovými prolinovými nebo glycinovými zbytky. 3) Použití azidové metody (v nepřítomnosti přebytku terciární báze a udržování nízkých teplot v reakčním prostředí). 4) Aplikace aktivována. estery aminokyselin, aminolýza na-rykh probíhá přes přechodný stav, stabilizátor. vodíkové můstky (např. estery vytvořené s N-hydroxypiperidinem a 8-hydroxychinolinem). 5) Použití karbodiimidové metody s přídavkem N-hydroxysloučeniny. nebo u Lewise.

Spolu se syntézou peptidů v roztocích je důležitá syntéza peptidů pomocí nerozpustných nosičů. Zahrnuje syntézu peptidů v pevné fázi (p-tion nebo Maryfieldova metoda) a syntézu peptidů pomocí polymerních činidel.

Strategie syntézy peptidů na pevné fázi zajišťuje dočasnou fixaci syntetizovaného peptidového řetězce na nerozpustném polymerním nosiči a provádí se podle schématu:

Díky této metodě bylo možné nahradit velmi složité a časově náročné postupy separace a čištění meziproduktu. peptidy s jednoduchými promývacími a filtračními operacemi, jakož i ke snížení procesu syntézy peptidů na standardní sekvenci periodicky se opakujících postupů, které lze snadno automatizovat. Merrifieldova metoda umožnila výrazně urychlit proces syntézy peptidů. Na základě této metodiky různé typy automat syntetizátory peptidů.

Připojení je vysoce výkonné. syntéza peptidů na pevné fázi se separačními schopnostmi preparativní HPLC poskytuje přístup ke kvalitativně nové úrovni chemikálií. syntéza peptidů, což má naopak příznivý vliv na rozvoj dekomp. oblasti biochemie, říkají. biologie, genetické inženýrství, biotechnologie, farmakologie a medicína.

Strategie syntézy peptidů za použití polymerních činidel poskytuje dočasnou vazbu na vysokou mol. aktivátor nosiče. karboxylová složka nebo kondenzační činidlo syntézy peptidů. Výhodou této metody je, že činidla připojená k polymeru mohou být zavedena v přebytku a separace syntetizovaných peptidů od nerozpustných polymerů není obtížná.

Příkladem takové syntézy je průchod amino složky v dané sekvenci několika. kolony, z nichž každá je spojena s polymerem

Jako rukopis

MELNIKOV Igor Olegovič

VÝVOJ MIKROMETOD PRO ANALÝZU AMINOKYSELIN,

KRÁTKÉ PEPTIDY A OLIGONUKLEOTIDY

POUŽITÍ RP HPLC A KAPILÁRY

ELEKTROFORÉZA

Specialita: 02.00.02 - Analytická chemie

Disertační práce pro stupeň kandidáta chemických věd

MOSKVA 2006 Disertační práce byla provedena na katedře analytické chemie Moskevské státní akademie jemné chemické technologie pojmenované po V.I.

M.V. Lomonosova a ve skupině analytické chemie proteinů Ústavu bioorganické chemie. akademici M.M. Shemyakin a Yu.A. Ovčinnikov RAS.

vědecký poradce:

Kandidát chemických věd, docent Glubokov Jurij Michajlovič

Oficiální oponenti:

Doktor chemických věd, profesor Makarov Nikolaj Vasiljevič Kandidát chemických věd Kirillova Yuliya Gennadievna

Vedení organizace:

Bio institut chemická fyzika jim. N.M. Emanuel RAS

Obhajoba se bude konat 20. prosince 2006 ve 12 00 na zasedání Rady pro disertační práci D 212.120.05 na Moskevské státní akademii jemné chemické technologie pojmenované po A.I. M.V. Lomonosova na adrese: 119571, Moskva, Vernadsky Avenue, 86, pokoj. M-119.

Disertační práci lze nalézt v knihovně Moskevské státní akademie jemné chemické technologie. M.V. Lomonosov.

Vědecký tajemník Rady pro disertační práci, kandidát chemických věd Yu.A. Efimová Relevantnost práce. V současné době se klinický výzkum stále více zaměřuje na využití metod instrumentální mikroanalýzy pro diagnostiku nejběžnějších a nejnebezpečnějších společensky významných onemocnění. Značná část těchto metod plně a ne vždy zajišťuje jejich včasnou a kvalitní diagnostiku, která často neodpovídá moderním požadavkům na sledování biochemického stavu člověka.

Velký funkční význam mají volné aminokyseliny a krátké peptidy, které jsou součástí fyziologických tekutin. V některých případech mohou působit jako molekulární markery určitých onemocnění.

Změna jejich koncentrace je často spojena s metabolickými poruchami, které indikují vývoj určitého onemocnění. Většina existujících metod analýzy aminokyselin je buď nedostatečně citlivá a selektivní pro jejich identifikaci, nebo vyžaduje derivatizaci aminokyselin, což výrazně komplikuje proces jejich stanovení. Problém jednoduché a ekonomické analýzy volných geneticky kódovaných aminokyselin není dosud zcela vyřešen. Současně klinická analýza aminokyselin vyžaduje jejich pre- nebo post-kolonovou modifikaci pro vysoce citlivé a selektivní stanovení. Změny v obsahu molekulárních markerů ve fyziologických tekutinách mohou souviset i s genetickou predispozicí pacienta k určitému onemocnění. Z toho vyplývá potřeba komparativní analýzy fragmentů DNA za účelem zvýšení spolehlivosti určení příčiny studovaného onemocnění a účinnější terapie.

Mezitím je dovážené vybavení potřebné pro analýzu aminokyselin a nukleotidů zpravidla drahé a pro většinu klinických laboratoří nedostupné. Situaci ztěžuje skutečnost, že mnoho přístrojů je vysoce specializovaných pro každý typ onemocnění, v důsledku čehož dochází k mnohonásobné duplicitě diagnostických metod jak po stránce přístrojové, tak metodické.

To dramaticky zvyšuje náklady na klinické studie a komplikuje srovnání. I.V. Nazimovovi za neustálou pomoc, pozornost a diskusi o výsledcích.

získané výsledky analýzy. Vývoj nových metod rozšiřujících možnosti využití veřejných analytických zařízení domácí produkce pro vysoce citlivé expresní a spolehlivé stanovení volných i modifikovaných aminokyselin, krátkých peptidů a oligonukleotidů jak pro strukturní analýzu biopolymerů a jejich fragmentů, tak pro klinické diagnostické účely je naléhavým vědeckým úkolem.

Objektivní. cíl disertační práce je vývoj komplexu instrumentálních vysoce citlivých mikrometod pro analýzu volných a modifikovaných aminokyselin, krátkých peptidů a oligonukleotidů s využitím domácí instrumentální báze.

Vědecká novinka.

1. Byly vyvinuty metody pro stanovení nemodifikovaných geneticky kódovaných α-aminokyselin pomocí metod kapilární zonální elektroforézy a micelární elektrokinetické chromatografie s přímou UV fotometrickou a refraktometrickou detekční metodou.

2. Byly vyvinuty a v klinické praxi aplikovány techniky pro společné stanovení nízkomolekulárních aminothiolů v krevní plazmě pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie s reverzní fází a kapilární zonální elektroforézy s fluorimetrickou a přímou UV fotometrickou detekcí.

3. Byla vyvinuta metoda stanovení fragmentů mutantního genu pro žilní trombózu založená na analýze alelicky specifických produktů polymerázové řetězové reakce kapilární gelovou elektroforézou s fluorimetrickou detekcí.

Praktický význam . Vyvinutá metoda analýzy aminokyselin umožňuje stanovit mikrokvantity geneticky kódovaných aminokyselin bez jejich předběžné derivatizace, což značně zjednodušuje stávající schéma analýzy. Byla vyvinuta a pro praktické využití navržena sada metod pro analýzu molekulárních markerů cévních příhod (homocystein, cystein, glutathion) a také fragmentů mutantního genu pro žilní trombózu. V důsledku provedené práce bylo možné ukázat možnost efektivního využití domácího zařízení pro biochemickou analýzu proteinových i nukleových složek na stejném zařízení pro kapilární elektroforézu. Stanovení aminokyselin a peptidů obsahujících síru v krevní plazmě podle metody vyvinuté v této práci bylo využito k posouzení rizikového faktoru u desítek pacientů se spolehlivě prokázaným infarktovým a předinfarktovým stavem. Výsledky provedené práce byly využity při tvorbě a praktickém testování biomedicínské analýzy univerzálního ekonomického automatizovaného komplexu přístrojů a metod pro molekulární diagnostiku některých společensky významných onemocnění (infarkt, cévní mozková příhoda, trombóza), vyvinutého v ústavu analytické instrumentace Ruské akademie věd.

Vzato na obranu:

způsoby stanovení geneticky kódovaných aminokyselin ve vodném roztoku bez jejich předběžné derivatizace pomocí kapilární zonální elektroforézy a micelární elektrokinetické chromatografie;

optimalizované podmínky pro derivatizaci nízkomolekulárních plazmatických aminothiolů pomocí fluorogenních činidel (monobromobiman a 5-jodacetamidofluorescein);

metoda analýzy nízkomolekulárních aminothiolů v krevní plazmě pomocí RP HPLC a kapilární elektroforézy;

výsledky stanovení obsahu homocysteinu v krevní plazmě pomocí RP HPLC a kapilární zonální elektroforézy;

způsob stanovení mutantního genu pro žilní trombózu pomocí kapilární gelové elektroforézy v lineárním poly-N,N'dimethylakrylamidu.

Schválení práce. Hlavní výsledky práce byly prezentovány na 8. celoruském sympoziu o molekulární kapalinové chromatografii a kapilární elektroforéze (15.-19. října 2001, Moskva, Rusko), 3. mezinárodním sympoziu o separačních metodách v biologických vědách (13.-18. května 2003, Moskva, Rusko). , ), Mezinárodní konference studentů a postgraduálních studentů základních věd "Lomonosov-2005" (chemická sekce. 12.-15. dubna 2005, Moskva, Rusko), 2. vědecká a praktická konference "Aktuální problémy lékařské biotechnologie" (12.-14. září 2005, Anapa, Rusko), 3. kongres Společnosti biotechnologů Ruska pojmenovaný po. Yu.A. Ovchinnikova (25.-27. října 2005, Moskva, Rusko), 1. konference mladých vědců MITHT pojmenovaná po. M.V. Lomonosov (13.-14. října 2005, Moskva, Rusko), Mezinárodní kongres analytických věd ICAS-2006 (25.-30. června 2006, Moskva, Rusko), 31. mezinárodní kongres Federace evropských biochemických společností (24.-29. června , Istanbul, Turecko), 26. mezinárodní sympozium o separaci proteinů, peptidů a polynukleotidů (16.-20. října 2006, Innsbruck, Rakousko).

Publikace. Na základě materiálů disertační práce bylo publikováno 12 prací ve formě článků a abstraktů zpráv.

Struktura diplomové práce. Disertační práce se skládá z úvodu, literární rešerše, experimentální části, diskuse výsledků, závěrů a seznamu citované literatury.

Disertační materiál je prezentován na 147 stranách, obsahuje 19 tabulek a 42 obrázků. Seznam literárních zdrojů tvoří 187 titulů.

V úvodu je uvedeno zdůvodnění tématu, jsou formulovány cíle studia a ustanovení předkládaná k obhajobě, je poznamenána jeho vědecká novost a praktický význam. Jsou uvedeny údaje o schválení a zveřejnění výsledků výzkumu, jakož i o struktuře a objemu disertační práce.

1. kapitola. Jsou uvedeny obecné informace o existujících metodách analýzy studovaných sloučenin. Podrobněji jsou popsány chromatografické metody a řada konvenčních identifikačních metod. Jsou zvažovány metody pro stanovení nízkomolekulárních aminothiolů v krevní plazmě a také fragmentů DNA. Jsou porovnány stávající metody analýzy aminokyselin, krátkých peptidů a oligonukleotidů a je doložena relevance dalšího výzkumu v této oblasti.

2. kapitola. Jsou uvedeny údaje o materiálech, činidlech, způsobech přípravy použitých roztoků a provedení práce.

3. kapitola. Výsledky a diskuse.

Obsah volných aminokyselin (AA) ve fyziologických tekutinách je diagnostickým parametrem pro řadu onemocnění. Provedená studie je zaměřena na vývoj metodiky, která umožňuje jejich rychlé a spolehlivé oddělení a identifikaci. Analýza směsí těchto AA byla provedena pomocí kapilární zónové elektroforézy (CZE) a micelární elektrokinetické chromatografie Index lomu AA pomocí CZE pomocí pro směsi AA pomocí CZE s refraktometrickou detekcí, délka 90 cm, efektivní délka 75 cm.

A) Pufr: 60 mM boritan sodný, pH 11,0. Napětí: 20 kV. Síla proudu: 93 μA. Teplota: 21,0 °C optimálního složení elektronu pozadí Doba nástřiku vzorku: 7,0 s (elektrokinetika, napětí nástřiku vzorku - 5 kV). Představení trollové. K tomu bylo provedeno množství AA - 0,1 ng; alanin, tyrosin - 0,2 ng.

4 - Prolin; 5 - alanin; 6 - tyrosin; 7 - serin; - kyselina asparagová; 9 - Methionin.

Tlumivé systémy CAPS, stejně jako jejich různé kombinace na příkladu modelové směsi 8 AA s radikály různé povahy a vlastností a maximálně odlišnými hodnotami pKa aminoskupiny. Příklad separace takové směsi pomocí boritanového podpůrného elektrolytu je na obr.1.

Optimálním základním elektrolytem pro separaci volného AA touto metodou je roztok obsahující 60 mM borátový pufr (pH 11,0).

To bylo používáno ke studiu vlivu různé faktory(napětí, proudová síla, vnitřní průměr a efektivní délka kapiláry, způsob nástřiku vzorku) na účinnost separace a ukazuje se, že za experimentálních podmínek není možné zcela oddělit směs všech kódovaných AA. Z experimentu vyplývá, že jsou přijatelné separované AA, u kterých rozdíl v době migrace přesahuje 1 min. Z tohoto důvodu nelze klasickou metodou CZE v přítomnosti kloubu oddělit a identifikovat glycin, alanin, valin, leucin, isoleucin, histidin, fenylalanin a tyrosin, stejně jako kyseliny asparagové, glutamové a cystein. Koeficient selektivity pro ně je velmi nízký a blízký 1. Arginin, lysin, prolin, serin, kyselina asparagová a methionin lze snadno izolovat a identifikovat; AK s dobou migrace 5,5-10,0, 15 a 19,5-20,8 min. Koeficient selektivity pro tuto skupinu AA má hodnotu v rozmezí 1,1 - 1,3. Při použití fosfátového základního elektrolytu (pH 11,4) byl pozorován podobný obecný separační vzor, ​​ale s horším rozlišením píku. Provedené studie ukazují, že klasická CZE s refraktometrickým zakončením umožňuje v nejlepším případě úplnou separaci a identifikaci ve vodném roztoku nejvýše 8 AA. Přitom obsah jednotlivých AA z uvedených neoddělitelných v takové směsi by neměl přesáhnout dva.

Separační účinnost AA se znatelně zlepší, když se k podpůrným elektrolytům s pH 7 přidá methanol. Při použití 150 mM fosfátového pufru (pH 2,0) s přídavkem 30 % obj. methanolu se podařilo oddělit 16 z 20 geneticky kódovaných AA (obr. 2). Bohužel úplné oddělení této směsi vyžaduje značný čas.

Kapilára: vnitřní průměr 75 µm, celková délka 65 cm, účinná délka 50 cm.

Teplota: 28,0 °C. Doba nástřiku vzorku: 1,5 s (vakuum).

Identifikace: 1 - lysin, 2 - arginin, 3 - histidin, 4 - glycin, 5 - alanin, 6 - valin, 7 - isoleucin, 8 - leucin, 9 - serin, 10 - threonin, 11 - methionin, 12 - fenylalanin 13 - kyselina glutamová, 14 - prolin, 15 - kyselina asparagová, 16 - tyrosin.

Protože aplikovaná klasická CZE při pH 7 neposkytovala požadovanou kvalitu separace, bylo rozhodnuto pro analýzu volných AA použít metodu MEKC s přímou UV detekcí. Dodecylsulfát sodný (SDS) byl přidán jako detergent do roztoků pufru. V průběhu práce byly použity různé koncentrace složek pozadí elektrolytu. Nejlepších výsledků bylo dosaženo za použití podpůrného elektrolytu obsahujícího 133 mM kyseliny borité, 33 mM boritanu sodného a 100 mM SDS, pH 9,5. Použití elektrolytu uvedeného složení výrazně zvýšilo počet analyzovaných AA při současném jejich stanovení při hodnotách pH pozadí elektrolytu ležícího v hlavní oblasti. Na Obr. 3 ukazuje elektroferogram směsi 14 AA.

Rýže. 3. Separace směsi 14 volných AA micelární elektrokinetickou chromatografií s přímou UV detekcí Kapilára: vnitřní průměr 50 µm, celková délka 122 cm, efektivní délka 35 cm.

133 mM kyselina boritá, 33 mM tetraboritan sodný (pH 9,5) 100 mM dodecylsulfát sodný. Napětí: 20 kV. Síla proudu: 48 uA. Teplota: 27,5oC. Doba nástřiku vzorku: 3,0 s (vakuum).

Podávaná množství AA byla 5,0 ng. Alanin, valin, isoleucin a glycin - 7,0 ng.

Identifikace: 1 - Valin, 2 - Alanin, 3 - Isoleucin, 4 - Glycin, 5 - Serin, 6 - Threonin, 7 - Tyrosin, 8 - Histidin, 9 - Fenylalanin, 10 - Arginin, 11 - Lysin, 12 - Cystein, 13 - Methionin, 14 - Kyselina glutamová. * - Systémové špičky.

Pozornost je věnována získaným hodnotám migračních časů.

I přes kratší efektivní délku kapiláry jsou zpravidla vyšší než u klasických CZE, což je v dobrém souladu s povahou MEKC. To může být také způsobeno velikostí aplikovaného napětí na jednotku délky kapiláry. Rozdíl v době migrace potřebný pro separaci AA je mnohem menší než v případě CZE. Stačí, aby to bylo 0,5 minuty.

Byla provedena podrobnější studie podmínek pro separaci 14 geneticky kódovaných AA, které jsou obvykle přítomny v krevní plazmě zdravých dárců ve volném stavu. Byl studován vliv pH a přídavků různých organických rozpouštědel do nosného elektrolytu na stupeň rozlišení píku. Z experimentu vyplývá, že pro dosažení úplné separace směsi 14 AA by hodnota pH měla ležet v rozmezí 9,0-10,0. Při pH mimo specifikovaný rozsah není zajištěno potřebné rozlišení AK. Je zřejmé, že při pH 9 je to způsobeno rozdílem mezi hodnotami pKa (AA) a při pH 10 je to způsobeno částečným rozkladem konjugátů DDSNAK. Účinek přidání organického rozpouštědla byl studován za použití methanolu, 2-propanolu a acetonitrilu. Získaná data ukazují, že přidání jakéhokoli organického rozpouštědla vede k významné změně migračních časů a selektivních koeficientů. Povaha změny je určena povahou a koncentrací přísady. Methanol a acetonitril nezlepšují separaci studovaných AA, což je zřejmě způsobeno jejich nízkou schopností tvořit smíšené konjugáty AA-DDSN-R, kde R je molekula organického rozpouštědla. Přídavek 3-5% 2-propanolu výrazně zlepšuje stupeň rozlišení složek s relativně malým prodloužením doby migrace AA. Se zvýšením koncentrace 2-propanolu je pozorováno znatelné prodloužení doby migrace AA, což vede ke snížení rychlosti stanovení. Speciální studie ukázaly, že k nejlepší separaci AA v přítomnosti účinného množství organického rozpouštědla (2-propanolu) dochází, pokud nosný elektrolyt obsahuje 50 mM kyseliny borité, 33 mM boritanu sodného a 50 mM SDS. Na Obr. 4 ukazuje elektroferogram směsi 14 AA.

Tato data ukazují efektivní separaci 13 ze 14 geneticky kódovaných AA. Celková doba separace nepřesáhne min. Sr času migrace je 0,03. Mírně vyšší hodnoty Sr, blízké 0,06-0,08, jsou pozorovány pro alanin, valin a histidin.

Rýže. 4. Separace směsi 14 AA pomocí MEKC s přímou UV detekcí Kapilára: vnitřní průměr 75 µm, celková délka 61 cm, efektivní délka 41 cm.

Pufr: 33 mM tetraboritan sodný, 100 mM kyselina boritá, 50 mM SDS, 5 % 2-propanol, pH = 10,2. Napětí: 25 kV. Síla proudu: 65 μA. Teplota: 29,5 °C. Doba nástřiku vzorku: 1,5 s (vakuum). Podávaná množství AA byla 0,5 ng.

Identifikace: 1 - Lysin; 2 - Prolin; 3 - fenylalanin; 4 - alanin; 5 - Valin; 6 - glycin;

7 - Histidin; 8 - tyrosin; 9 - Leucin + Isoleucin; 10 - serin; 11 - Threonin; 12 - kyselina glutamová; 13 - Cystein.

Dosažená úroveň rozlišení umožnila provést studie kvantitativního stanovení uvažovaných AA. Byla provedena analýza modelové směsi 14 AA známého složení. Studie ukázaly, že metoda MEKC s přímou UV detekcí za použití boritanového tlumivého roztoku obsahujícího 3–5 % 2-propanolu umožňuje kvantifikovat 14–16 geneticky kódovaných AA s chybou (Sr) 6–8 % v méně než 30 min. Správnost získaných výsledků byla dodatečně provedena metodou "zavedeno-nalezeno" (tab. 1) Ověření správnosti stanovení obsahu geneticky kódovaného AA metodou MEKC (mo(AA) = 0,50 ng; zavedeno - 1,00 ng) Analýza homocysteinu a dalších nízkomolekulárních plazmatických aminothiolů Homocystein (Hcy) a jeho doprovodné aminothioly (AT) (kódovaná aminokyselina - cystein (Cys), tripeptid glutathion (GSH)) v krevní plazmě jsou molekulární markery dysfunkce kardiovaskulárního systému. Hlavním účelem této studie bylo vyvinout metodu pro stanovení obsahu homocysteinu jako spolehlivého rizikového faktoru pro tato onemocnění.

Kvantitativní analýza aminothiolů s nízkou molekulovou hmotností v krevní plazmě zahrnuje obnovu disulfidových vazeb, deproteinizaci krevní plazmy, modifikaci aminothiolů vhodnými činidly, separaci a identifikaci modifikovaných aminothiolů pomocí RP HPLC nebo CE s tou či onou detekční metodou. V této práci byly oxidované a na protein vázané aminothioly redukovány trifenylfosfinem. EDTA byla použita k odstranění kationtů těžkých kovů. Navržený redukční postup poskytl rychlou (15 minut) a úplnou redukci (96 %) disulfidů a uvolnění sulfhydrylových skupin při teplotě místnosti. Výtěžky redukčních reakcí byly stanoveny standardní metodou pro měření obsahu volných protilátek. Plazmatické proteiny s vysokou molekulovou hmotností byly vysráženy kyselinou 5-sulfosalicylovou.

Jeho koncentrace byla během studie optimalizována, aby se zabránilo ztrátě citlivosti v důsledku ředění během kroku neutralizace.

Volné sulfhydryly byly modifikovány monobrombimanem (mBrB) nebo 5-jodacetamidofluoresceinem (5-IAF). Požadované pH bylo udržováno diethanolaminem (pKa = 8,9) a orthofosforečnanem sodným v závislosti na činidle použitém k modifikaci AT. Použití diethanolaminu umožnilo přímou kontrolu tvorby cílových produktů pomocí hmotnostní spektrometrické analýzy. K identifikaci AT derivátů byly použity fotometrické a fluorimetrické metody detekce. Deriváty byly charakterizovány absorpční, fluorimetrickou a hmotnostní (MALDI-TOF, ESI) spektroskopií. Fotometrická a fluorimetrická detekce byla provedena při vlnových délkách vybraných z absorpčních spekter (Hcy-MW, 234 nm) a fluorescenčních spekter derivátů Hcy (390 nm (excitace) a 478 nm (fluorescence)). Z fluorescenčního spektra konjugátu Hcy-AF vyplývá, že při fluorimetrické detekci je optimální vlnová délka pro excitaci 462 nm a pro fluorescenci 504 nm.

Pro sjednocení metod stanovení a ověření zásadní možnosti použití stejného detektoru pro identifikaci derivátů monobymane i fluoresceinu jsme studovali účinnost excitace na vlnové délce 390 nm. Intenzita získaného fluorescenčního maxima a v důsledku toho i citlivost stanovení byla o řád nižší než při použití pro excitaci záření o vlnové délce 462 nm.

Byly analyzovány jednotlivé monobrombimanové (MB) a acetamidofluoresceinové (AF) deriváty AT a také jejich modelové směsi. Jednotlivé monobrombimanové deriváty Cys, Hcy a GSH byly eluovány s retenčními časy (min) 6,01 ± 0,19, 10,76 ± 0,17, respektive 11,89 ± 0,11 (obr. 5)1.

Stejný retenční čas je zachován při použití směsí aminothiolů známého složení. Získaná experimentální data umožnila vypočítat výtěžek modifikační reakce. Bylo to nejméně 97 %, což je v dobré shodě se známými údaji, ale získané za přísnějších podmínek přípravy vzorku. Výsledné deriváty byly izolovány ze směsi a charakterizovány hmotnostní spektrometrií.

Fluorescenční deriváty Cys, Hcy a GSH se eluovaly s retenčními časy (min) 8,49±0,12; 10,46 ± 0,15, respektive 12,96 ± 0,14 (obr. 6).

Chromatografická analýza byla provedena na domácím vysoce výkonném kapalinovém chromatografu "MiliChrom A-02" (EkoNova, Novosibirsk). Obr. 5. RP HPLC modelové směsi aminothiolů modifikovaných monobrombimanem. Cys-MB-50,0 uM, Hcy-MB-25,0 uM, GS-MB-25,0 uM.

Fluorometrická detekce (ex = 390 nm, ex = 478 nm) Obr. 6. RP HPLC modelové směsi aminothiolů modifikovaných 5-jodacetamidofluoresceinem. Cys-AF-100,0 uM, Hcy-AF-150,0 uM, GS-AF uM. Fluorometrická detekce (abl = 390 nm, exp = 478 nm) Při použití 5-IAF jako značky je dosaženo lepšího rozlišení píku thiol-fluorescenčních konjugátů ve srovnání s thiol-monobimanovými konjugáty. Výtěžek modifikační reakce AT 5-IAF, stanovený experimentálně poklesem intenzity píku fluorescenční značky, byl 95 %. Všechny získané deriváty byly izolovány ze směsi a charakterizovány hmotnostní spektrometrickou analýzou.

Získaná data posloužila jako základ pro vývoj metody pro kvantitativní stanovení homocysteinu. Pro sestrojení kalibrační křivky byly použity vzorky směsí s jeho obsahem od 2,5 do 100 μM. Zvolený interval zahrnuje rozsah fyziologických koncentrací Hcy (5-50 μM). Jako značka byl použit mBrB. Získaná kalibrační závislost plochy chromatografického píku na obsahu homocysteinu ve směsi je lineární v celém studovaném koncentračním rozmezí a je popsána rovnicí:

Relativní směrodatná odchylka výsledků stanovení podle plochy píku nepřesahuje 0,083 a podle výstupního času - 0,026. Detekční limit fluorimetrické detekce MW derivátů je 1 μM (obr. 7).

Rýže. Obr. 7. Změna plochy chromatografického píku od koncentrace Hcy Účinnost metody je potvrzena porovnáním chromatogramů získaných pro jednotlivé látky a pro vzorky krevní plazmy připravené podle navržené metody. Provedené studie umožnily vyvinout metodu pro kvantitativní stanovení homocysteinu, cysteinu a glutathionu v krevní plazmě a úspěšně ji využít pro rutinní analýzu výše uvedených protilátek ve formě jejich MB derivátů (obr. 8). . Při vývoji metodiky byla provedena dodatečná kontrola metodou „introduced-found“ (tab. 2).

Rýže. 8. RP HPLC krevní plazmy od zdravého dárce. Cys-MB-192,4 uM, HcyMB-10,1 uM, GS-MB-15,7 uM. Fluorimetrická detekce Stanovení Hcy ve formě MW derivátů pomocí mikrokolonové HPLC Pomocí vyvinuté metody bylo analyzováno více než 50 vzorků krevní plazmy od zdravých a pacientů s kardiovaskulárním onemocněním různé závažnosti. U zdravých pacientů byla průměrná hodnota (µM) protilátek v krevní plazmě získané ráno ze žíly nalačno:

pro Hcy 12,75 ± 3,21, pro GSH 9,53 ± 1,17 a pro Cys 206,34 ± 24,61. Získané hodnoty koncentrací spadají do rozmezí referenčních hodnot uvedených v literatuře. U pacientů trpících kardiovaskulárními chorobami byla koncentrace Hcy v krevní plazmě závislá na závažnosti onemocnění. Výsledky korelují s klinickým stavem pacientů.

Byla studována možnost analýzy protilátek pomocí levnější a běžnější metody detekce, jako je fotometrická. Experiment ukázal, že poskytuje citlivost, která umožňuje stanovit patologicky vysoký obsah protilátek v krevní plazmě. Při použití fotometrické detekce je vhodnější použít jako značku 5-IAF, protože v tomto případě je dosaženo maximálního rozlišení k základní linii (obr. 9), což umožňuje kvantifikaci.

Rýže. Obr. 9. RP HPLC modelových směsí aminothiolů modifikovaných (a) monobrombimanem a (b) 5-jodacetamidofluoresceinem. A) Cys-MB-50,0 uM, HcyMB-25,0 uM, GS-MB-25,0 uM. B) Cys-AF-50,0 uM, Hcy-AF-75,0 uM, GS-AF-25,0 uM. Fotometrická detekce (a = 234 nm, b = 250 a 300 nm) Provedená práce tedy umožnila optimalizovat fázi přípravy vzorku, provést ji za „mírných podmínek“ se zaručeným kvantitativním výtěžkem analyzované složky. Na jejím základě byla vyvinuta technika, která umožňuje rychle a spolehlivě stanovit obsah nízkomolekulárních protilátek v krevní plazmě zdravých i nemocných pacientů. Chyba měření nepřesahuje 8,5 %. Spodní hranice rozsahu naměřených koncentrací (2,5 μM) ukazuje na zásadní možnost využití této techniky pro stanovení nízkého obsahu Hcy v krevní plazmě. Detekční limit popsané metody je 1 μM. Vyvinutá technika byla testována na skutečných vzorcích krevní plazmy pacientů a lze ji použít pro rutinní použití.

Stanovení homocysteinu a dalších nízkomolekulárních plazmatických aminothiolů 10. CZE modelové směsi AT má migrační čas 6,18 ± 0,16; cysteinem modifikovaný mBrB Hcy-MB-700,0 uM, Cys-MB-300,0 uM 6,83 ± 0,20 a glutathion - 8,54 ± 0,17 min, v daném pořadí (obr. 10). V porovnání s GS-MB- 700,0 uM. (abs = 234 nm).

Kapilára: vnitřní průměr 50 µm, poloviční HPLC, použitá metoda CZE umožňuje délku 82 cm, efektivní délku 62 cm.

Pufr: 50 mM tetraboritan sodný pH=11,0. zkrátit dobu analýzy AT o 2-3 minuty.

Napětí: 25 kV. Síla proudu: 58 μA.

(vakuová) přímá UV detekce nestačí k detekci malého množství Hcy v krevní plazmě. Když je obsah homocystenu 10 μM, poměr signál/pozadí je 2,5-3 a relativní směrodatná odchylka je v rozsahu 0,3-0,5. Tato metoda je použitelná pro kontrolu obsahu Hcy v krevní plazmě pacientů s patologicky vysokými hladinami (25 µM). Relativní směrodatná odchylka pro tyto koncentrace je 0,12 pro MB-Cys, 0,18 pro MB-Hcy a 0,17 pro MB-GS.

Kapilární zonální elektroforéza s fluorimetrickou detekcí byla provedena na kapilárním iontovém analyzátoru Nanofor 02 (IanP RAS, Petrohrad). detekce (tabulka 3). Fotometrická detekce byla provedena při vlnové délce 492 nm, což odpovídá excitační vlnové délce 5-IAF. Při fluorimetrické detekci byla vlnová délka excitace 473 nm a vlnová délka emise byla 514 nm. Bylo zjištěno, že použití 5-IAF umožňuje zvýšit citlivost stanovení Hcy metodou CZE s fluorimetrickou detekcí.

Absorpce, 492 nm Obr. 11. CZE modelové směsi AT, mo Obr. 12. CZE modelové směsi protilátek modifikovaných 5-jodacetamido-modifikovaným 5-jodacetamidofluoresceinem s přímým UV fluoresceinem s fluorimetrickým Hcy-AF-100,0 µM, Cys-AF-300,0 µM, GS-AF- Hcy-AF-15 Obr. , 0 uM, Cys-AF-15,0 uM, GS-AF uM. (abs = 473 nm, exp = 514 nm) 700,0 uM. (abs = 492 nm).

Kapilára: vnitřní průměr 50 µm, kompletní Kapilára: vnitřní průměr 50 µm, celková délka 68 cm, účinná délka 53 cm, délka 65 cm, účinná délka 57 cm.

Pufr: 25 mM tetraboritan sodný, 25 mM fosfát Pufr: 25 mM tetraboritan sodný, 25 mM fosforečnan sodný pH = 11,2. Napětí: 20 kV. Aktuální síla: pH sodíku = 11,2. Napětí: 20 kV. Aktuální síla:

22 uA. Teplota: 25,0 °C. Vstupní čas je asi 18 μA. Teplota: 25,0 °C. Doba vstřiku vzorku: 5 s (elektrokinetika, napětí při d: 5 s (elektrokinetika, napětí při )

metoda kapilární gelové elektroforézy Změny v obsahu molekulárních markerů ve fyziologických tekutinách mohou být způsobeny i genetickou predispozicí pacienta k určitému onemocnění. Z toho vyplývá potřeba komparativní analýzy fragmentů DNA za účelem zvýšení spolehlivosti určení příčiny studovaného onemocnění a účinnější terapie.

V této práci jsme zkoumali možnost využití dostupného domácího CE vybavení k detekci mutací v molekulách DNA na příkladu fragmentů mutantního genu pro žilní trombózu pomocí alelově specifické PCR. Separace nukleotidů byla provedena kapilární gelovou elektroforézou (CGE) za použití nemodifikovaných kapilár z křemenného skla o průměru 25 až 100 μm. Jako separační matrice byl použit domácí lineární poly-N,N-dimethylakrylamid (pDMA). Volba tohoto polymeru je spojena s možností jeho použití ve verzi CGE čipu. pDMA byl syntetizován v CJSC Syntol z dimethylakrylamidového monomeru radikálovou polymerací. Délka řetězce byla řízena změnou teploty nebo přidáním lapačů radikálů. Použité polymery obsahující 5-8 % pDMA monomeru. Nosnými elektrolyty byly 0,1 M TBE (0,1 M TRIS, 0,1 M kyselina boritá a 2,5 mM EDTA; pH = 8,3) a 0,1 M TAPS (kyselina N-tric(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropansulfonová, pH = 8,3) Všechny testované polymery měl nízkou úroveň nativní fluorescence (0,5 AU). Polymery připravené pomocí 0,1 M TAPS umožňují až 5 separací bez doplňování kapiláry gelem, zatímco ty obsahující TBE umožňují maximálně 3 separace. Tyto polymery poskytují rozlišení srovnatelné s odpovídajícími západními protějšky, ale zároveň jsou cenově dostupnější.

Studie směsi fluorescenčně značených polynukleotidů o délkách 5-15n.o. respektive při obsahu 10–9 M každého z nich bylo možné stanovit optimální složení polymeru pro separaci oligonukleotidů s délkou řetězce do 100 n. (obr. 13). Jedná se o gel na bázi pDMA obsahující 6% monomer, 7M močovinu a 0,1M TAPS.

Rýže. 13. Separace směsi polynukleotidů o délkách Kapilára: vnitřní průměr - 50 µm, celková délka - 45 cm, efektivní délka - 38,5 cm Polymer: 6% pDMA monomer, 0,1M TAPS, 7M močovina. Pracovní elektrolyt: 0,1M TAPS. Napětí:

10 kV. Proud: 4,3 μA. Teplota: 25,0 °C. Doba nástřiku vzorku 10 s (elektrokinetika, odběrové napětí 10 kV).

Optimalizace separačních podmínek (napětí, proudová síla, efektivní délka a průměr kapiláry) umožnila dosáhnout separace na základní linii oligonukleotidů o celkové délce menší než 100 bp. a rozdíl v délce 1 ne. (obr. 14.).

Rýže. 14. Separace směsi polynukleotidů s rozdílem délky 1n.

Kapilára: vnitřní průměr - 50 µm, celková délka - 65 cm, efektivní délka - 57,5 ​​cm Polymer: 6% pDMA monomer, 0,1M TAPS, 7M močovina. Pracovní elektrolyt: 0,1M TAPS. Napětí:

11 kV. Proud: 5,1 μA. Teplota: 25,0 °C. Doba nástřiku vzorku 10 s (elektrokinetika, odběrové napětí 10 kV).

Získaná data byla použita jako základ pro vývoj systému pro rychlou a efektivní diagnostiku mutantního genu pro žilní trombózu (Leidenský gen pro faktor V lidského krevního koagulačního systému).

K prokázání možnosti společného stanovení produktů divokého a mutantního typu (rozdíl 5 nt) byla provedena následující PCR: 1.

DNA divokého typu (bez mutace) + primer divokého typu; 2. Divoký typ DNA (bez mutace) + primer FV Leiden; 3. DNA s heterozygotní mutací FV Leiden + primer FV Leiden; 4. primer FV Leiden bez DNA. Reakční produkty po ošetření formamidem a zředění vodou byly analyzovány pomocí CGE s fluorimetrickou detekcí. Analýza vzorků 1 a 3 ukázala přítomnost produktu ve směsi po PCR, zatímco vzorky 2 a 4 ukázaly jeho nepřítomnost. Pro potvrzení tohoto vzoru jsme analyzovali směs vzorků mutantního primeru/mutovaného produktu a primeru divokého typu/produktu divokého typu v poměru 1:1 (obr. 15).

Rýže. 15. Společné stanovení mutantního a nemutovaného produktu PCR Kapilára: vnitřní průměr - 50 µm, celková délka - 45 cm, efektivní délka - 38,5 cm Polymer 6% pDMA monomer, 0,1M TAPS, 7M močovina. Pracovní elektrolyt: 0,1M TAPS. Napětí: 12 kV.

Síla proudu: 6,5 μA. Teplota: 25,0 °C. Doba vzorkování: 10 s (elektrokinetika, vzorkovací napětí 10 kV).

Získaná data ukazují možnost společného stanovení produktů alelicky specifické PCR mutace FV Leiden a divokého typu. Navrhovaný přístup, jmenovitě selekce a syntéza alelově specifických primerů různých délek a společného protiprimeru, následovaná analýzou pomocí CGE s fluorimetrickou detekcí, lze rozšířit o diagnostiku dalších geneticky podmíněných onemocnění. Je třeba také poznamenat, že oligonukleotidy lze analyzovat pomocí standardního domácího zařízení používaného pro analýzu aminokyselin a krátkých peptidů.

1. Byly vyvinuty metody pro analýzu geneticky kódovaných aminokyselin bez jejich předběžné derivatizace pomocí micelární elektrokinetické chromatografie a kapilární zonální elektroforézy s refraktometrickou a přímou UV detekcí. Byl studován vliv složení a hodnoty pH nosného elektrolytu a také přídavku organických rozpouštědel na separační účinnost.

2. Pomocí micelární elektrokinetické chromatografie s přímou UV detekcí byla kvantifikována modelová směs 14 geneticky kódovaných volných aminokyselin.

3. Byla vyvinuta metoda pro rychlé a spolehlivé stanovení obsahu nízkomolekulárních aminothiolů v krevní plazmě zdravých i nemocných pacientů metodou HPLC s reverzní fází s fluorimetrickou detekcí. Je ukázána hlavní možnost použití této techniky pro stanovení nízkého obsahu homocysteinu v krevní plazmě. Vyvinutá technika byla testována na reálných vzorcích krevní plazmy pacientů.

4. Byla ukázána možnost stanovení patologicky vysokých koncentrací homocysteinu v krevní plazmě metodou kapilární zonální elektroforézy s fotometrickou detekcí. Vyvinutá technika byla testována na reálných vzorcích krevní plazmy pacientů. Byla studována možnost použití 5-jodacetamidofluoresceinu jako absorpční a fluorogenní značky.

5. Byla vyvinuta technika pro selektivní stanovení fragmentů mutantního genu pro žilní trombózu (mutace FV Leiden) kapilární gelovou elektroforézou s fluorimetrickou detekcí. Možnost analýzy nukleotidů s délkou řetězce až 100 n.b. a s rozdílem délky 1 n.o.

Hlavní materiály disertační práce jsou prezentovány v následujících dílech:

1. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Stukacheva E.A., Glubokov Yu.M. Stanovení obsahu homocysteinu a dalších nízkomolekulárních aminothiolů v krevní plazmě. // J. Anal. Chem. -2006. -T. 61.-č. 11.-S. 1185-1191.

2. Melnikov I.O., Glubokov Yu.M., Nazimov I.V. Kapilární elektroforéza volných aminokyselin s refraktometrickou a přímou UV detekcí. // Inf.-anal. býk. „Učené poznámky MITHT“ . M.:

MITHT. -2004. Problém. 11. -S. 54-57.

3. Melnikov I.O., Glubokov Yu.M., Nazimov I.V. Analýza nízkomolekulárních aminothiolů kapilární elektroforézou a RP HPLC s fluorescenční a přímou UV detekcí. // Zh. "Moderní technologie náročné na vědu". M.: Akademie přírodních věd, -2005. -Ne. 3. -str.40-41.

4. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Stukacheva E.A., Glubokov Yu.M. HPLC a HPCE stanovení homocysteinu jako vaskulárního kritéria rizikové faktory onemocnění. // FEBS J. -2006. -PROTI. 273.-S.1. -P. 256.

5. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Lobazov A.F., Popkovich G.V. Kapilární elektroforéza nemodifikovaných aminokyselin. // Tez. zpráva 8. celoruské symposium o molekulární kapalinové chromatografii a kapilární elektroforéze, Moskva, říjen 2001, s. 23.

6. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Lobazov A.F., Popkovich G.B. Kapilární elektroforéza kódovaných nemodifikovaných aminokyselin s refraktometrickou detekce. // 3. mezinárodní symposium o separacích v biovědách, Moskva, květen 2003, s. 263.

7. Melnikov I.O., Stukacheva E.A., Glubokov Yu.M., Nazimov I.V. Stanovení homocysteinu a dalších nízkomolekulárních aminothiolů v krevní plazmě pomocí KEF a RP HPLC. // Sborník příspěvků z mezinárodní konference studentů a doktorandů v základních vědách "Lomonosov-2005".

Moskva: Moskevská státní univerzita, 2005. Chemická sekce. -T. 1. -S. 31.

8. Nazimov I.V., Melnikov I.O., Glubokov Yu.M., Sivopliasova E.A. Instrumentální mikrometody pro stanovení homocysteinu jako rizikového faktoru kardiovaskulárních onemocnění. // Materiály 2. vědecko-praktické konference "Aktuální problémy lékařské biotechnologie", Anapa, září 2005, -S. 15-16.

9. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Sivopliasova E.A., Glubokov Yu.M. Mikrometody pro kvantitativní stanovení homocysteinu v krevní plazmě. // Sborník příspěvků z 3. kongresu Společnosti biotechnologů Ruska. Yu.A. Ovchinnikova, Moskva, říjen 2005, -S. 61.

10. Melnikov I.O., Sivoplyasova E.A., Glubokov Yu.M., Nazimov I.V. Stanovení rizikového faktoru kardiovaskulárních onemocnění pomocí chromatografických metod analýzy. // Sborník příspěvků z 1. konference mladých vědců MITHT them. M.V. Lomonosov, Moskva, říjen 2005, -S. 31.

11. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Stukacheva E.A., Glubokov Yu.M. Separace a identifikace nízkomolekulárních aminothiolů v krvi pomocí vysokoúčinná kapalinová chromatografie s reverzní fází a kapilární elektroforéza. // Mezinárodní kongres o analytických vědách ICAS-2006, Moskva, červen 2006, -P. 204.

12. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Patrushev L.I., Alekseev Ya.I., Glubokov Yu.M., Mosina A.G. Stanovení mutace lidského leidenského genu podle vysoce výkonná kapilární gelová elektroforéza. // 26. mezinárodní sympozium o separacích proteinů, peptidů a polynukleotidů, LMP, Innsbruck, Rakousko, říjen 2006, -P. 24.

Podobné práce:

«KOPCHUK Dmitrij Sergejevič FUNKCIONALIZOVANÉ 5-ARYL-2,2'-BIPYRIDINY A JEJICH LUMINESCENTNÍ KOMPLEXY S LANTHANIDY(III) 02.00.03. – Abstrakt disertační práce z organické chemie pro titul kandidáta chemických věd Jekatěrinburg 2010 Jelcin VĚDECKÝ PORADCE: doktor chemie Kozhevnikov Dmitrij Nikolajevič OFICIÁLNÍ SOUPEŘI: doktor chemie...»

"Venv Sergey Valerievich e Teoretická studie vlivu elektrostatických interakcí a primární struktury makromolekul na jejich samoorganizaci 02.00.06 - Vysokomolekulární sloučeniny ABSTRAKT disertační práce pro stupeň kandidáta fyzikálních a matematických věd Moskva - 2011 The práce byla provedena na katedře fyziky polymerů a krystalů Fyzikální fakulty Moskevské státní univerzity pojmenované po M.V. Lomonosov. Vědecký poradce: lékař...»

«NIKOLAEV ANDREY ALEKSANDROVITCH TEORETICKÁ A EXPERIMENTÁLNÍ STUDIE INTERAKCE INTERAKCÍ KOMPLEXNÍCH KOMBINOVANÝCH KOVŮ 6 A 1 0 SKUPINY PYS DIALK A LF O SF I TAM I 02.00.08 – Chemie organoelementových sloučenin disertace stupně ABSTRACT of the chemických věd Kazaň – 2008 Stát A. M. Butlerova ... “

«Vilesov Alexander Sergejevič ZÁŘENÍ-CHEMICKÁ SYNTÉZA POLYMERNÍCH FOREM FOSFORU V RŮZNÝCH MÉDIÍCH 02.00.01. – Anorganická chemie ABSTRAKT disertační práce pro udělení titulu kandidát chemických věd Moskva 2009 Mendeleeva Vedoucí: člen korespondent Ruské akademie věd, doktor chemie, profesor Tarasova Natalia Pavlovna Úředník...»

«Slovohotov Jurij Leonidovič ATOMOVÁ STRUKTURA A VLASTNOSTI KRYSTALOVÉ CHEMIE NOVÝCH FULLERENOVÝCH DERIVÁTŮ 02.00.03 – organická chemie 02.00.04 – fyzikální chemie ABSTRAKT disertační práce pro titul doktora chemických věd Moskva - 2007 Ústav organoelementových sloučenin Ruské akademie věd doktor chemie, oficiální...»

"Varnavskaya Olga Alekseevna FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÉ CHARAKTERISTIKY KOMPLEXNÍ TVORBY NEODIMA (III) A EUROPIA (III) S 2,2-DIPYRIDYLEM V ORGANICKÝCH MÉDIÍCH RŮZNÉ POLARITY 02.00.04 - fyzikální chemie Abstrakt disertační práce pro titul kandidáta chemických věd Tomsk - 2010 Práce byla zpracována na Altajské státní univerzitě, Barnaul Školitel: Kandidát chemických věd, docent Smagin Vladimir Petrovič Oficiální oponenti: Dr....»

„Krasnova Tatyana Alexandrovna Hmotnostní spektrometrie s matricovou (povrchovou) aktivovanou laserovou desorpcí / ionizací při identifikaci a stanovení oligomerů polysulfonových, polykarboxylových kyselin a antibiotik 02.00.02 - analytická chemie ABSTRAKT disertační práce pro stupeň kandidáta chemických věd Saratov - 2013 Práce byla provedena na katedře chemie Vladimirské státní univerzity pojmenované po Alexandru Grigorievich a Nikolai Grigorievich ... "

« ANALÝZA Specialita 02.00.02 - Analytická chemie ABSTRAKT disertační práce pro udělení titulu kandidáta chemických věd Tomsk - 2012 www.sp-department.ru Práce byla provedena na Federálním státním rozpočtovém vzdělávacím institutu pro vyšší odborné vzdělávání Národní výzkum. .."

«SMIRNOV Aleksey Aleksandrovich FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÉ PROCESY V NEROVNOVÁMNÉ NÍZKOTEPLOTNÍ PLAZMOVÉ HBr A JEJÍ SMĚSI S ARGONEM, HELIEM A VODÍKEM 02.00.04 – Fyzikální chemie Abstrakt dizertační práce pro stupeň fyzikální a matematické vědy0 se uskutečnilo na Státní univerzitě chemické a technologické v Ivanově . Školitel: doktor chemie, profesor Efremov Alexander Michajlovič Oficiální oponenti:...»

"Vasjutin Oleg Alekseevič studující vlivy podmínek syntézy na adsorpční vlastnosti ferrypinnelu a povrchové vlastnosti ferrothrunátu yttria metody potenciometrie a smáčení specialita 02.00.11 - Koloidní chemie Abstrakt autora disertační práce o soutěži o vědeckou hodnost kandidáta chemických věd St. Petersburg 2012 práce byla provedena na Katedře koloidní chemie Chemické fakulty St.-Petersburg State...»

«Melnikova Tatyana Igorevna ROZVOJ TEORETICKÝCH A EXPERIMENTÁLNÍCH ZÁKLADŮ PRO STANOVENÍ SLOŽENÍ A STRUKTURNÍCH VLASTNOSTÍ BISMUTU A SILLENITOVÝCH BORATŮ Specialita 02.00.21 Chemie pevných látek ABSTRAKT disertační práce byl zpracován na 1. stupeň kandidáta chemické látky v Moskvě katedra fyziky a státní chemie pevných látek moskevských chemických technologií pojmenovaná po M.V. Lomonosov Vědecký poradce: lékař ... "

«Starostina Irina Alekseevna ACIDOBAZICKÉ INTERAKCE POLYMERŮ A KOVŮ V LEPÍCÍCH SLOUČENINÁCH 02.00.06 – Vysokomolekulární sloučeniny ABSTRAKT disertační práce pro titul doktora chemie Kazaň – 2011 1 www.sp-department.ru Vědecký konzultant doktor technických věd, profesor Stojanov Oleg Vladislavovič Oficiální oponenti doktor...»

«VASILIEV Vladimir Petrovič SPEKTRÁLNÍ - LUMINESCENTNÍ VYŠETŘOVÁNÍ INTERMOLEKULÁRNÍCH INTERAKCÍ do METALLOCENOVÝCH KOMPLEXŮ Zr a Hf v ŘEŠENÍCH 02.00.04. – fyzikální chemie Abstrakt disertační práce pro titul kandidáta chemických věd Černogolovka – 2008 Práce byla zpracována v Ústavu problémů chemické fyziky Ruské akademie věd a Pedagogickém institutu Jižní federální univerzity Školitel: kandidát chemické vědy LUKOVA Galina Viktorovna Oficiální...»

"SHPANCHENKO Olga Valerievna FUNKČNÍ TOPOGRAFIE DOPRAVY-MATRIX RNA 02.00.10 - bioorganická chemie ABSTRAKT disertační práce pro titul doktora chemie Moskva - 2010 2 Práce byla zpracována na Katedře chemie přírodních látek Fakulty chemické Moskevský stát...“

«KOSHELEVA Ekaterina Valentinovna PEVNÉ ELEKTROLYTY V SYSTÉMECH CaY2S4-Yb2S3 a CaYb2S4-Y2S3 Specializace: 02.00.05 – Elektrochemie ABSTRAKT dizertační práce pro stupeň kandidáta chemických věd Jekatěrinburg - 2014 Candisoev of Chemical Sciences, Profesorka Chemie Lykse Lynina , Vyatka State University,...»

„Lavrentieva Ekaterina Konstantinovna Templování v systémech obsahujících jíl jako metoda řízení vlastností polymerních kompozitních sorbentů a platinových elektrokatalyzátorů Speciality: 02.00.06 – makromolekulární sloučeniny 02.00.05 – elektrochemie ABSTRAKT disertační práce pro stupeň a stupeň kandidáta Matematické vědy Moskva – 2009 Práce na katedře fyziky ... "

"Korchagina Evgenia Viktorovna AGREGACE CHITOSANU A JEHO DERIVÁTY VE ZŘEDĚNÝCH VODNÝCH ROZTOCÍCH 02.00.06 - makromolekulární sloučeniny, fyzikální a matematické vědy a Abstrakt dizertační práce pro stupeň kandidáta fyzikálních a matematických věd Moskva - 2012 Práce byla zpracována na katedře fyziky polymerů a krystalů Fyzikální fakulty Moskevské státní univerzity...

«Vorobeva Ekaterina Georgievna CHIRÁLNÍ KOMPLEXY PALADIA NA BÁZI DUSÍKOVÝCH DERIVÁTŮ PŘÍRODNÍCH MONOTERPENOIDŮ 02.00.03 – Organická chemie ABSTRAKT dizertační práce pro titul kandidáta chemických věd Perm - 2011 S.yktyvka Státní univerzita FGBOU Vědecký poradce: Olga Zalevskaya...»

«Rykunov Alexey Aleksandrovich PŘENOSNOST KVANTO-TOPOLOGICKÝCH ATOMOVÝCH A VAZBOVÝCH DESKRIPTORŮ V ŘADĚ SUBSTITUOVANÝCH HYDROPYRIMIDINY specialita 02.00.04 - fyzikální chemie ABSTRAKT disertační práce pro titul kandidáta chemických věd na katedře Qua2011 Práce v Moskvě - chemie Chemie, Fakulta přírodních věd, Ruská chemicko-technologická univerzita. DI. Mendělejev Školitel: doktor fyzikálních a matematických věd, profesor...»

«KORSHUN Vladimir Arkadevich MODIFIKOVANÉ PYRIMIDINOVÉ NUKLEOSIDY A NENUKLEOOSIDOVÁ REAGENCIE PŘI SYNTÉZE OLIGONUKLEOSIDOVÝCH KONJUGÁTOV, JEJICH VLASTNOSTI A POUŽITÍ Moskva 02.00.10 – Bioorganická chemie – Bioorganická chemie ABSTRAKT 20. stupeň nukleozidové chemie Synthesis Laboratories and Group...»