फार्माकोकाइनेटिक रिसर्च एंड बायोअवेलेबिलिटी - जर्नल ऑफ फार्माकोकाइनेटिक्स एंड फार्माकोडायनामिक्स। अमीनो एसिड और पेप्टाइड्स की एचपीएलसी और केशिका क्रोमैटोग्राफी का उपयोग

प्रतिलिपि

1 नोवोसिबिर्स्क राज्य विश्वविद्यालय प्राकृतिक विज्ञान संकाय विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान विभाग कोर्स वर्करिवर्स फेज एचपीएलसी में पेप्टाइड्स के रिटेंशन वॉल्यूम और यूवी स्पेक्ट्रा की भविष्यवाणी द्वारा किया गया: एयू कुचकिना, जीआर। 147 वैज्ञानिक सलाहकार: पीएच.डी. अजारोवा आई.एन. नोवोसिबिर्स्क-2005

2 सामग्री 1. प्रस्तावना साहित्य समीक्षा 2.1। पेप्टाइड्स। पेप्टाइड्स के एमिनो एसिड एचपीएलसी आरपी एचपीएलसी में पेप्टाइड्स के प्रतिधारण मात्रा और यूवी स्पेक्ट्रा की भविष्यवाणी प्रायोगिक भाग परिणाम और चर्चा 4.1। क्रोमैटोग्राफिक सिस्टम की स्थिरता की निगरानी पेप्टाइड्स के प्रतिधारण संस्करणों की गणना रैखिक मॉडल "प्रतिधारण संरचना" नॉनलाइनियर मॉडल "प्रतिधारण संरचना" पेप्टाइड्स के यूवी स्पेक्ट्रा की गणना निष्कर्ष संदर्भ परिशिष्ट

3 1. परिचय प्रोटिओमिक्स जीनोम संरचना के बारे में ज्ञात जानकारी के आधार पर जीवित कोशिकाओं में कार्य करने वाले प्रोटीन की पहचान को आधुनिक आणविक जीव विज्ञान के सबसे महत्वपूर्ण कार्यों में से एक माना जाता है। यह समस्या पिछले कुछ वर्षों में कुछ जीवों के जीनोम की पूरी तरह से डिकोडिंग के बाद सामने आई है। यह पता चला कि जीनोम शरीर द्वारा उन्हें पैदा करने की तुलना में कई अधिक प्रोटीनों को कूटबद्ध करता है। सभी प्रोटीनों के योग में रुचि के प्रोटीन की पहचान एक जटिल कार्यप्रणाली समस्या है जिसे एक नियम के रूप में, प्रत्यक्ष विधि द्वारा हल नहीं किया जा सकता है। ऐसी समस्याओं को हल करने के तरीकों में से एक, जिसे पेप्टिडोमिक्स कहा जाता है, यह है कि प्रोटीन का योग एक विशिष्ट प्रोटीज द्वारा हाइड्रोलाइज्ड होता है, और गठित पेप्टाइड्स का योग केशिका वैद्युतकणसंचलन या उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) द्वारा अलग किया जाता है। अंतिम लक्ष्य एक ज्ञात संरचना के पेप्टाइड (पेप्टाइड्स) को खोजना है, जो अध्ययन के तहत जीव के जीनोम द्वारा एन्कोड किए गए प्रोटीन का एक प्राथमिक टुकड़ा है (हैं)। यदि नमूने में ऐसा पेप्टाइड पाया जाता है, तो यह निष्कर्ष निकाला जाता है कि यह प्रोटीन शरीर द्वारा निर्मित होता है। ऐसी समस्याओं को हल करते समय उत्पन्न होने वाली पद्धतिगत समस्याओं को 2 समूहों में विभाजित किया जा सकता है। पहली समस्या एक मिश्रण को अलग करना है, जिसमें आमतौर पर कई हजार पेप्टाइड्स होते हैं। पृथक व्यक्तिगत पेप्टाइड्स की संरचना की दूसरी परिभाषा। पृथक्करण समस्या को प्राथमिक मिश्रण के विभाजन द्वारा हल किया जाता है और बाद में अलग-अलग अंशों को अलग-अलग घटकों में अलग किया जाता है। दूसरी समस्या मुख्य रूप से मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक विधियों द्वारा हल की जाती है, जो अंततः व्यक्तिगत घटकों (पेप्टाइड्स) के आणविक भार को निर्धारित करना संभव बनाती है। यदि पेप्टाइड में पर्याप्त रूप से "अद्वितीय" संरचना (अमीनो एसिड का एक सेट) है, जैसे कि, एक नियम के रूप में, लंबे (अमीनो एसिड अवशेषों से अधिक) पेप्टाइड्स -, तो इसका आणविक भार भी "अद्वितीय" होगा, और इसकी संभावना गलत पहचान नगण्य हो जाती है। चूंकि पेप्टाइड पृथक्करण प्रक्रिया का उद्देश्य पेप्टाइड को अमीनो एसिड के एक ज्ञात सेट के साथ अलग करना है, सवाल उठता है: क्या एचपीएलसी कॉलम से ऐसे पेप्टाइड के रिलीज समय की भविष्यवाणी करना संभव है, इसकी जानकारी अमीनो एसिड संरचना? इस दृष्टिकोण को पहली बार 1980 के दशक की शुरुआत में प्रदर्शित किया गया था। इस अध्ययन का उद्देश्य एक मास स्पेक्ट्रोमीटर में प्रत्यक्ष इंजेक्शन के लिए उपयुक्त मोबाइल चरण का उपयोग करके रिवर्स चरण एचपीएलसी (आरपी ​​एचपीएलसी) मोड में मिलिक्रोम ए-02 क्रोमैटोग्राफ पर पेप्टाइड्स के प्रतिधारण मात्रा की भविष्यवाणी करने के लिए एक विधि विकसित करना था। 3

4 2. साहित्य समीक्षा 2.1. पेप्टाइड्स। अमीनो एसिड पेप्टाइड्स पेप्टाइड बॉन्ड (-NH-CO-) से जुड़े α-एमिनो एसिड अवशेषों से निर्मित बायोपॉलिमर हैं। पेप्टाइड के सामान्य सूत्र को निम्नानुसार दर्शाया जा सकता है: NH 2 CH CO NH CH CO ... NH CH R 1 R 2 Rn प्रोटीन और पेप्टाइड्स के बीच कोई स्पष्ट सीमा नहीं है, एक नियम के रूप में, पेप्टाइड्स बायोपॉलिमर होते हैं जिनमें से अधिक नहीं होते हैं 100 अमीनो एसिड अवशेष। अमीनो एसिड कोई भी कार्बनिक अम्ल होता है, जिसके अणुओं में एक अमीनो समूह शामिल होता है, अक्सर इस नाम का अर्थ ठीक α- अमीनो एसिड होता है, क्योंकि वे महान जैविक महत्व के हैं। प्रोटीन बनाने वाले अधिकांश प्राकृतिक अमीनो एसिड के अणुओं में होता है सामान्य सूत्रएच 2 एनसीएच आर जैसा कि संरचनात्मक सूत्र से देखा जा सकता है, अमीनो एसिड (प्रोलाइन के अपवाद के साथ) केवल साइड चेन आर की संरचना में एक दूसरे से भिन्न होते हैं। अमीनो एसिड एम्फोटेरिक यौगिक होते हैं, क्योंकि उनके अणु में एक एसिड कार्बोक्सिल दोनों शामिल होते हैं। समूह और एक बुनियादी अमीनो समूह। अत्यधिक अम्लीय माध्यम में, कार्बोक्सिल समूह मुख्य रूप से गैर-पृथक होता है, और अमीनो समूह प्रोटोनेट होता है। प्रबल क्षारीय माध्यम में, अमीनो समूह मुक्त आधार के रूप में होता है, और कार्बोक्सिल समूह कार्बोक्सिलेट आयन के रूप में होता है। क्रिस्टलीय अवस्था में, अमीनो एसिड एक zwitterion के रूप में मौजूद होते हैं, जहां एक प्रोटॉन को कार्बोक्सिल समूह से अमीनो समूह में स्थानांतरित किया जाता है। प्राकृतिक पेप्टाइड्स और प्रोटीन के जैवसंश्लेषण में केवल 20 अमीनो एसिड शामिल होते हैं। अमीनो एसिड और उनके गुण तालिका 1 में दिखाए गए हैं। तालिका 1. अमीनो एसिड और उनके गुण। एमिनो एसिड नाम कोड संरचना पीके ए - -एनएच 2 -आर ग्लाइसीन जीएच 2.35 9.78 एलानिन ए एच 3 सी 2.35 9.87 वेलिन वीएच 3 सी सीएच सीएच 3 2.29 9.74 4

5 एमिनो एसिड कोड संरचना का नाम पीके ए - -एनएच 2 -आर ल्यूसीन एलएच 3 सी सीएच सीएच 3 2.33 9.74 आइसोल्यूसीन आईएच 3 सी * सीएच सीएच 3 2.32 9.76 एच 2 सी प्रोलाइन पी एचसी एनएच 1.95 10.64 फेनिलएलनिन एफ 2.20 9.31 ट्रिप्टोफैन डब्ल्यूएनएच सीएच एनएच 2 2.46 9.41 टायरोसिन वाई एचओ सीएच एनएच 2 2.20 9.21 10.46 सेरीन एस एचओ 2.19 9.21 थ्रेओनाइन टी एचओ * सीएच सीएच 3 2.09 9.10 सिस्टीन सी एचएस 1.92 10.70 8.37 एसपारटिक एसिड डी एचओओसी 1.99 9.90 3.36 ग्लूटामिक एसिड ई 47 4.07 एस्पारा 10. एनएच 2 एनसीओ 2.14 8.72 ग्लूटामाइन क्यूएच 2 एनसीओ 2.17 9.13 लाइसिन केएच 2 एन 2.16 9.06 10.54 आर्जिनिन आरएच 2 एनसी एनएच 1.82 8.99 12.48 एनएच हिस्टिडीन एचएन एनएच 1, 80 9.33 6.04 मेथियोनीन एमएच 3 सीएस 2.13 9.28 5

साइड चेन की प्रकृति के आधार पर, अमीनो एसिड को दो समूहों में विभाजित किया जाता है: गैर-ध्रुवीय (हाइड्रोफोबिक) स्निग्ध या सुगंधित आर-समूह वाले अमीनो एसिड; ध्रुवीय (हाइड्रोफिलिक) आर-समूहों के साथ अमीनो एसिड। पहले समूह में 8 अमीनो एसिड शामिल हैं: ऐलेनिन, वेलिन, ल्यूसीन, आइसोल्यूसीन, मेथियोनीन, प्रोलाइन, फेनिलएलनिन, ट्रिप्टोफैन। सात अमीनो एसिड में साइड चेन में समूह होते हैं जो नकारात्मक या सकारात्मक चार्ज ले सकते हैं: पीएच 7.0 पर एसपारटिक और ग्लूटामिक एसिड नकारात्मक रूप से चार्ज होते हैं; लाइसिन, आर्जिनिन, हिस्टिडाइन मूल अमीनो एसिड हैं जिनकी साइड चेन को सकारात्मक रूप से चार्ज किया जा सकता है; क्षारीय परिस्थितियों में, टायरोसिन और सिस्टीन के पक्ष समूहों को नकारात्मक रूप से चार्ज किया जा सकता है।पेप्टाइड्स का एचपीएलसी पेप्टाइड्स के मिश्रण को अलग करना एक बहुत ही मुश्किल काम है। वर्तमान में आरपी एचपीएलसी पेप्टाइड्स के पृथक्करण के लिए सबसे महत्वपूर्ण तरीका है। पेप्टाइड्स ध्रुवीय पदार्थ होते हैं, जो स्थिर चरण की हाइड्रोफोबिक सतह के साथ उनकी बातचीत को रोकता है और अवशिष्ट सिलानॉल समूहों के साथ बातचीत की ओर जाता है। सिलनोल समूहों के साथ बातचीत को कम करने के लिए, मजबूत एसिड या लवण को एलुएंट में जोड़ा जाता है। पेप्टाइड्स की ध्रुवीयता को कम करने के लिए, क्रोमैटोग्राफी को कम ph मान (3 से नीचे) पर किया जाना चाहिए। यदि इन सिद्धांतों का पालन किया जाता है, तो एचपीएलसी पेप्टाइड्स को अलग करने के लिए एक बहुत ही लचीली विधि साबित होगी। यह इस तथ्य के कारण है कि इस पद्धति को उच्च पृथक्करण दर, परिणामों की पुनरुत्पादकता और पदार्थों की माइक्रोग्राम मात्रा का विश्लेषण करने की क्षमता की विशेषता है। आरपी एचपीएलसी का एक अन्य लाभ अस्थिर सॉल्वैंट्स की एक छोटी मात्रा में अंशों को इकट्ठा करने की क्षमता है, जो आगे बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्रिक विश्लेषण को सरल करता है। एक नियम के रूप में, 0.1% - ट्राइफ्लोरोएसेटिक और फॉर्मिक एसिड का उपयोग वाष्पशील सॉल्वैंट्स के रूप में किया जाता है। ट्राईफ्लोरोएसेटिक एसिड यूवी क्षेत्र में 205 एनएम तक पारदर्शी होता है, जो जटिल मिश्रणों की क्रोमैटोग्राफी के लिए एक बड़ा फायदा है। इसके अलावा, पेप्टाइड्स ट्राइफ्लोरोएसेटिक एसिड में अत्यधिक घुलनशील होते हैं। उल्टे चरणों से पेप्टाइड्स का क्षालन, एक नियम के रूप में, एक कार्बनिक संशोधक के अतिरिक्त के साथ एक ढाल मोड में किया जाता है। सबसे आम कार्बनिक संशोधक एसीटोनिट्राइल है। यह यूवी क्षेत्र में 200 एनएम तक पारदर्शी है और इसमें अच्छी चयनात्मकता है। 6

पेप्टाइड्स के विश्लेषण के लिए आरपी एचपीएलसी के व्यापक उपयोग को निर्धारित करने वाला एक अन्य कारक उनके क्रोमैटोग्राफिक व्यवहार की भविष्यवाणी करने की क्षमता है आरपी एचपीएलसी में पेप्टाइड्स के प्रतिधारण मात्रा और यूवी स्पेक्ट्रा की भविष्यवाणी करना यह विचार है कि पेप्टाइड्स के क्रोमैटोग्राफिक व्यवहार में 25 से कम अमीनो एसिड अवशेष होते हैं। उन्हें पहले जे. मीक द्वारा व्यक्त अमीनो एसिड संरचना को जानकर भविष्यवाणी की जा सकती है। उल्टे चरण में पेप्टाइड्स की अवधारण अमीनो एसिड अवशेषों की हाइड्रोफोबिसिटी द्वारा निर्धारित की जाती है जो उनकी संरचना बनाते हैं। सुगंधित या बड़े स्निग्ध अमीनो एसिड अवधारण के लिए प्रमुख योगदानकर्ता हैं। पूर्वगामी के आधार पर, मीक ने पेप्टाइड को बनाने वाले अमीनो एसिड अवशेषों के योगदान के योग के रूप में उल्टे चरण में पेप्टाइड्स की अवधारण मात्रा की गणना करने का प्रस्ताव रखा। उन्होंने "रचना प्रतिधारण" का एक रैखिक (योगात्मक) मॉडल प्रस्तावित किया: वी आर = वी 0 + जेड एन * + जेड सी * + जेड आई (1) जहां वी आर पेप्टाइड की अवधारण मात्रा है; वी 0 कॉलम की मुक्त मात्रा है; जेड एन * और जेड सी *, क्रमशः, मुक्त -एनएच 2 और - या पेप्टाइड के संशोधित अंत समूहों का योगदान; Z i - i-th अमीनो एसिड (अवधारण स्थिरांक) का योगदान। नम्र क्रोमैटोग्राफ ने ढाल आरपी एचपीएलसी के तहत 25 पेप्टाइड्स और, उलटा समस्या को हल करते हुए, अमीनो एसिड प्रतिधारण स्थिरांक की गणना की। निर्भरता के सहसंबंध गुणांक वी आर (कैल्क।) = एफ (वी आर (एक्सपी।)) 0.997 (पीएच 2.1 पर) और 0.999 (पीएच 7.4 पर) थे। उच्च सहसंबंध गुणांक के बावजूद, यह मॉडल भौतिक अर्थ का खंडन करता है, क्योंकि इस तरह से प्राप्त अमीनो एसिड के प्रतिधारण स्थिरांक उनकी हाइड्रोफोबिसिटी में वास्तविक अंतर को नहीं दर्शाते हैं और कुछ योगदानों में नकारात्मक मूल्य हैं। इसके अलावा, ऐसे कई तथ्य हैं जिनके अनुसार, एक पेप्टाइड में अमीनो एसिड अवशेषों की संख्या में वृद्धि के साथ, एक उलट चरण के साथ इसके हाइड्रोफोबिक संपर्क की सतह, जो अवधारण को निर्धारित करती है, गैर-रैखिक रूप से बढ़ जाती है। काम के लेखकों ने यह भी धारणा बनाई कि पेप्टाइड्स की अवधारण मात्रा की गणना अमीनो एसिड अवशेषों के योगदान के योग से की जाती है। पेप्टाइड्स की अवधारण मात्रा की गणना करने के लिए, उन्होंने निम्नलिखित मॉडल का प्रस्ताव दिया: वी आर = ए * एलएन (1+ जेड जे * एन जे) + बी (2) 7

8 जहां जेड जे एक अनुभवजन्य प्रतिधारण पैरामीटर है, जिसकी गणना अमीनो एसिड की हाइड्रोफोबिसिटी के आधार पर की जाती है; ए और बी स्थिरांक हैं; n j पेप्टाइड में j अमीनो एसिड अवशेषों की संख्या है। यह मॉडल पेप्टाइड्स की गणना और प्रयोगात्मक अवधारण मात्रा के बीच एक अच्छा संबंध प्रदान करता है। मॉडल का नुकसान यह है कि यह केवल एक विशिष्ट क्रोमैटोग्राफिक सिस्टम (किसी दिए गए ढलान के साथ रैखिक ढाल, निश्चित प्रवाह दर, मोबाइल और स्थिर चरणों) के लिए मान्य है। इस प्रकार, इस मॉडल का अनुप्रयोग बहुत सीमित है। इसलिए, विचाराधीन काम के लेखकों ने ग्रेडिएंट रेफरेंस के सिद्धांत पर आधारित एक और मॉडल का प्रस्ताव रखा, जो क्रोमैटोग्राफिक सिस्टम की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए पेप्टाइड्स के प्रतिधारण मात्रा की गणना करने की अनुमति देता है। यह ध्यान में रखते हुए कि एक स्थिर चरण के साथ पेप्टाइड के हाइड्रोफोबिक संपर्क का उपलब्ध क्षेत्र 2/3 शक्ति के आणविक भार के अनुपात में भिन्न होता है, लेखकों ने पेप्टाइड्स की अवधारण मात्रा की गणना के लिए एक फ़ंक्शन का चयन किया: VR = f ( 3) जहां ए, बी, सी एक विशेष क्रोमैटोग्राफिक सिस्टम के गुणों के आधार पर स्थिरांक हैं, इस उद्देश्य के लिए चुने गए 15 पेप्टाइड्स के क्रोमैटोग्राफी पर डेटा से प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित किए गए थे। निर्भरता का सहसंबंध गुणांक VR (calc.) = F (v R (exp.)) 0.98 था। एक महत्वपूर्ण कमी जो इस पद्धति के अनुप्रयोग को सीमित करती है, वह है मॉडल पेप्टाइड्स के साथ प्रारंभिक प्रयोगों से एक विशिष्ट क्रोमैटोग्राफिक प्रणाली के लिए स्थिरांक ए, बी और सी की गणना करने की आवश्यकता है, जो एक बहुत ही श्रमसाध्य प्रक्रिया है। इस काम में, एक ज्ञात अमीनो एसिड अनुक्रम के साथ पेप्टाइड्स के अवधारण मात्रा और यूवी स्पेक्ट्रा की गणना की गई थी, जो पहले उपरोक्त मापदंडों के लिए अमीनो एसिड के योगदान को निर्धारित करते थे। इन योगदानों के मूल्यों को प्रयोगात्मक रूप से मल्टीवेव फोटोमेट्रिक डिटेक्शन द्वारा प्राप्त व्यक्तिगत अमीनो एसिड के समाधान के क्रोमैटोग्राम से उन्हीं परिस्थितियों में पाया गया, जिनमें पेप्टाइड्स क्रोमैटोग्राफ किए गए थे। काम के लेखकों ने पेप्टाइड्स के प्रतिधारण मात्रा की गणना के लिए निम्नलिखित समीकरण का प्रस्ताव दिया: VR = 209 [(Z i) + ZC * + N * + V 0] 1/3 990 (4) जहां Z i का अवधारण गुणांक है अमीनो एसिड "आई"; V 0 कॉलम का फ्री वॉल्यूम है; Z C * + N * पेप्टाइड के अंतिम समूहों का कुल प्रतिधारण स्थिरांक है। पेप्टाइड्स के यूवी स्पेक्ट्रा की गणना करते समय, पेप्टाइड के स्पेक्ट्रम को इसके सभी संरचनात्मक तत्वों के स्पेक्ट्रा के योग के रूप में माना जाता था। प्रस्तावित विधि का परीक्षण करने के लिए 8 . थे

9, 30 पेप्टाइड्स क्रोमैटोग्राफ किए गए थे, और गणना और प्रयोगात्मक रूप से पाए गए अवधारण संस्करणों के बीच सहसंबंध गुणांक 0.95 था। पेप्टाइड्स के यूवी स्पेक्ट्रा की गणना के लिए प्रस्तावित विधि में भी संतोषजनक भविष्य कहनेवाला शक्ति है। विचाराधीन कार्य में, एसीटोनिट्राइल और लिथियम परक्लोरेट (0.2 M LiCLO M HClO 4) का एक जलीय घोल, जो एक गैर-वाष्पशील पदार्थ है, का उपयोग एलुएंट्स के रूप में किया गया था, जो पेप्टाइड्स की बाद की मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक पहचान को बहुत कठिन बना देता है। इसलिए, एसिटोनिट्राइल - ट्राइफ्लोरोएसेटिक एसिड की संरचना के मोबाइल चरण का उपयोग करके एक विधि विकसित करना हमें उचित लगा, जिसके सभी घटक वाष्पशील पदार्थ हैं और मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक विश्लेषण में हस्तक्षेप नहीं करते हैं। 9

10 3. प्रायोगिक एचपीएलसी एक मिलिक्रोम ए-02 क्रोमैटोग्राफ पर 2x75 मिमी कॉलम पर एक प्रोटोसिल सी 18 एक्यू चरण (बिशॉफ एनालिसेंटेक्निक अंड गेरेट जीएमबीएच, जर्मनी) के साथ निम्नलिखित परिस्थितियों में किया गया था: एलुएंट ए: 0.01 एम ट्राइफ्लोरोएसेटिक एसिड; एलुएंट बी: एसीटोनिट्राइल; रैखिक ढाल: 40 ​​मिनट 5 से 100% बी; प्रवाह दर: 100 μl / मिनट; स्तंभ तापमान: 40 सी; पता लगाना: 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280 और 300 एनएम पर, = 0.18 एस; नमूना मात्रा: 4 μL। क्रोमैटोग्राफिक प्रणाली के परीक्षण के लिए समाधान: केबीआर - 0.2 मिलीग्राम / एमएल; यूरिडीन - 0.2 मिलीग्राम / एमएल; कैफीन -1 मिलीग्राम / एमएल; एम-नाइट्रोएनिलिन - 0.1 मिलीग्राम / एमएल; ओ-नाइट्रोएनिलिन-0.1 मिलीग्राम / एमएल; पानी में विलायक 2% एसीटोनिट्राइल। कम से कम 98% के मुख्य पदार्थ के द्रव्यमान अंश वाले सभी अभिकर्मक। काम में अमीनो एसिड ("सर्वा", जर्मनी), एसीटोनिट्राइल "ग्रेड 0" (एनपीएफ "क्रायोक्रोम", सेंट पीटर्सबर्ग), निर्जल ट्राइफ्लोरोएसेटिक एसिड ("आईसीएन बायोमेडिकल्स", यूएसए) का उपयोग किया गया था। पेप्टाइड के नमूने कृपया वी.वी. सामुकोव (एनपीओ वेक्टर, नोवोसिबिर्स्क) और आई.वी. नाज़िमोव (आईबीसीएच आरएएस, मॉस्को)। क्रोमैटोग्राफ समाधान में अमीनो एसिड की एकाग्रता 0.2-1 मिलीग्राम / एमएल, पेप्टाइड्स - 0.1-2 मिलीग्राम / एमएल थी। क्रोमैटोग्राम को मल्टीक्रोम प्रोग्राम (ZAO एम्परसेंड, मॉस्को) का उपयोग करके संसाधित किया गया था। वी आर की गणना करने के लिए, 8 तरंग दैर्ध्य (एस ) पर पता लगाने के दौरान क्रोमैटोग्राफिक चोटियों के क्षेत्रों और पेप्टाइड्स के क्रोमैटोग्राम की ग्राफिकल प्रस्तुति, कार्यक्रम "क्रोम पी" (जेडएओ इंस्टीट्यूट ऑफ क्रोमैटोग्राफी "इकोनोवा", नोवोसिबिर्स्क) का उपयोग किया गया था। चित्र 1 में दिखाए गए वक्र का रैखिककरण Microsoft Excel प्रोग्राम (Microsoft Corporation,) का उपयोग करके किया गया था। 10

11 4. परिणाम और उनकी चर्चा 4.1. क्रोमैटोग्राफिक प्रणाली की स्थिरता की निगरानी विधि द्वारा विनियमित प्रक्रिया का उपयोग करके क्रोमैटोग्राफिक प्रणाली की स्थिरता की निगरानी की गई थी। परीक्षण समाधान क्रोमैटोग्राफ किया गया था और प्राप्त क्रोमैटोग्राम से 14 मापदंडों की गणना की गई थी, जिनमें से प्रत्येक क्रोमैटोग्राफिक प्रणाली के एक निश्चित संकेतक को नियंत्रित करता है: वी आर ब्रोमाइड आयन मुक्त स्तंभ मात्रा; यूरिडीन का वर्णक्रमीय अनुपात एस 280 / एस 250, 250 से 280 एनएम की सीमा में डिटेक्टर ट्यूनिंग सटीकता; स्पेक्ट्रल अनुपात एस 260/एस 280 कैफीन का, डिटेक्टर की रैखिक सीमा; वर्णक्रमीय अनुपात एस 260 / एस 230 एम-नाइट्रोएनिलिन एलुएंट ए की उपयुक्तता। ओ-नाइट्रोएनिलिन शिखर के अनुसार, निम्नलिखित की निगरानी की गई थी: निर्दिष्ट आकार से ग्रेडिएंट का वीआर विचलन, वर्णक्रमीय अनुपात, 210 से रेंज में डिटेक्टर ट्यूनिंग सटीकता 300 एनएम, शिखर की विषमता स्तंभ पैकिंग में 10% उल्लंघन, एस 210 नमूना वितरण सटीकता। मॉडल समाधान के क्रोमैटोग्राफिक और वर्णक्रमीय मापदंडों के आवधिक माप ने हमें इस्तेमाल किए गए क्रोमैटोग्राफिक सिस्टम की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्यता को सत्यापित करने की अनुमति दी। परीक्षण के परिणाम तालिका 2 में दिखाए गए हैं। तालिका 2। क्रोमैटोग्राफिक प्रणाली के परीक्षण के परिणाम, n = 8. पदार्थ पैरामीटर 11 पैरामीटर का औसत मूल्य एस आर (%) वीआर ब्रोमाइड, μl 148 1.0 यूरिडीन एस 280 / एस 250 0.53 1.3 कैफीन एस 260 / एस 280 0.73 0.6 एम-नाइट्रोएनिलिन एस 260 / एस 230 0.80 1.0 ओ-नाइट्रोएनिलिन वीआर, μl, 6 एस 220 / एस 210 1.71 0.5 एस 230 / एस 210 1.76 0.7 एस 240 / एस 210 1.11 0.6 एस 260 / एस 210 0.58 0.9 एस 250 / एस 210 0.40 1.4 एस 280 / एस 210 0.59 0.9 एस 300 / एस 210 0.32 1.2 ए 10% 1.05 1.1 आउटपुट सिग्नल (पीक क्षेत्र) एस 210, पीपी। μl 25.00 1.4

12 प्राप्त एस आर मान हमें वर्णित क्रोमैटोग्राफिक प्रणाली की स्थिरता के बारे में निष्कर्ष निकालने की अनुमति देते हैं। पेप्टाइड्स के प्रतिधारण मात्रा की गणना। समीकरण द्वारा गणना की गई: Z i = V Ri V 0 ZC * + N * (5) जहां वी री अमीनो एसिड "i" की अवधारण मात्रा है; वी 0 फ्री कॉलम वॉल्यूम (रिटेंशन वॉल्यूम Br -, इस क्रोमैटोग्राफिक सिस्टम में यह 148 μl था); Z C + N पेप्टाइड के अंतिम समूहों का कुल प्रतिधारण स्थिरांक है। ZC + N की गणना समीकरण के अनुसार की गई: ZC * + N * = VR (G) V 0 ((6) जहां VR (G) ग्लाइसिन की अवधारण मात्रा है, μl; VR (GGG) और v R (GG) पेप्टाइड्स जीजीजी और जीजी के प्रतिधारण मात्रा हैं, μl अंत समूहों के प्रतिधारण कारकों का योग [(-एनएच 2) + (-CONH 2)] समूहों के प्रतिधारण कारकों के योग के बराबर माना जाता था [(- NH 2) + (-)]। क्रोमैटोग्राफिक डेटा और पेप्टाइड्स के संरचनात्मक तत्वों के परिकलित अवधारण स्थिरांक तालिका 3 में दिए गए हैं। तालिका 3. अमीनो एसिड और पेप्टाइड्स की अवधारण मात्रा जीजी और जीजीजी पेप्टाइड्स के संरचनात्मक तत्वों के प्रतिधारण स्थिरांक VR कोड, μl Z i, μl VR कोड, μl Z i, μl NPSVGMQYDIHLTFEWK GG C GGG A (C * + N *) अंत - 25 R

13 रैखिक मॉडल "रचना प्रतिधारण" कार्य में प्रस्तावित रैखिक मॉडल के भीतर पेप्टाइड्स की अवधारण मात्रा की भविष्यवाणी करने के लिए, हमने 28 पेप्टाइड्स (तालिका 4) की अवधारण मात्रा की गणना की और प्रयोगात्मक रूप से प्राप्त डेटा के साथ प्राप्त डेटा की तुलना की (छवि 1) . तालिका 4. प्रायोगिक रूप से पाया गया और पेप्टाइड्स (रैखिक मॉडल) की अवधारण मात्रा की गणना की गई। पेप्टाइड वी.आर. (समा।) एल वी आर (calc।), एल 1 जीजी GGG के रूप में GRGDS TKPR WAGGDASGE जीएल मेरी KPVGKKRRPVKVYP WD-YGGDASGE WD-AGGDA NCMLDY SYSMEHFRWG WD-VGGDASGE YGGFLRKYPK RPPGFSPFR MEHFRWG RVYIHPF YGGFLRRIRPKLK YGGFM DRVYIHPF QATVGDINTERPGMLDFTGK ELYENKRPRRPYIL DRVYIHPFHL YD-AGFL RPKPQQFFGLM - NH PQQFFGLM-NH GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRQQ-NH

14 वी वीआर आर (कैल्क।), L वीआर (एक्सपी।), आर μL अंजीर। 1. पेप्टाइड्स के प्रयोगात्मक रूप से पाए गए और परिकलित अवधारण मात्राओं की तुलना। वी आर मूल्यों की गणना समीकरण (1) के अनुसार की गई थी। जैसा कि प्राप्त आंकड़ों से देखा जा सकता है, रैखिक मॉडल केवल अपेक्षाकृत हाइड्रोफिलिक पेप्टाइड्स के लिए संतोषजनक परिणाम देता है; हाइड्रोफोबिक पेप्टाइड्स के लिए, गणना किए गए मान प्रयोगात्मक लोगों की तुलना में काफी अधिक हैं। इसी तरह के परिणाम काम में प्राप्त किए गए थे नॉनलाइनियर मॉडल "रचना प्रतिधारण" अंजीर में दिखाए गए वक्र का रैखिककरण। 1, समीकरण देता है: वी आर = 173 [(एन जेड i) + वी 0] 1/3 785 (7) परिकलित मूल्यों की तुलना और 28 पेप्टाइड्स के लिए प्रयोगात्मक रूप से प्राप्त अवधारण मात्रा तालिका 5 और अंजीर में दिखाया गया है।

15 वी आर (कैल्क।), आईएल वीआर वीआर (एक्सपी।), एल वी आर अंजीर। 2. पेप्टाइड्स की प्रयोगात्मक रूप से मिली और गणना की गई अवधारण मात्रा की तुलना। वी आर मूल्यों की गणना समीकरण (7) के अनुसार की गई थी। 15

16 तालिका 5. पेप्टाइड्स (गैर-रैखिक मॉडल) के प्रायोगिक रूप से पाया और परिकलित अवधारण मात्रा। पेप्टाइड वी.आर. (समा।) एल वी आर (calc।), एल 1 जीजी GGG के रूप में GRGDS TKPR WAGGDASGE जीएल मेरी KPVGKKRRPVKVYP WD-YGGDASGE WD-AGGDA NCMLDY SYSMEHFRWG WD-VGGDASGE YGGFLRKYPK RPPGFSPFR MEHFRWG RVYIHPF YGGFLRRIRPKLK YGGFM DRVYIHPF QATVGDINTERPGMLDFTGK ELYENKRPRRPYIL DRVYIHPFHL YD-AGFL RPKPQQFFGLM - NH PQQFFGLM-NH GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH निर्भरता का सहसंबंध गुणांक VR (calc.) = F (v R (exp.)) 0.96 था। परिशिष्ट में 11 पेप्टाइड्स के एक मॉडल मिश्रण के प्रयोगात्मक और परिकलित क्रोमैटोग्राम हैं। सोलह

17 4.3. पेप्टाइड्स के यूवी स्पेक्ट्रा की गणना हमारे क्रोमैटोग्राफिक सिस्टम में, वर्णक्रमीय अनुपात की सही गणना प्रणालीगत चोटियों के साथ-साथ हाइड्रोफिलिक अमीनो एसिड और शॉर्ट पेप्टाइड्स की कमजोर अवधारण में बाधा है। विशिष्ट वर्णक्रमीय गुणांक के मान तालिका 6 में दिए गए हैं। तालिका 6। पेप्टाइड्स के संरचनात्मक तत्वों के वर्णक्रमीय गुणांक, यूवी विकिरण को अवशोषित करने वाले क्रोमैटोग्राफिक चोटियों के क्षेत्रों के रूप में C = 1 मिमी और 4 μl का नमूना मात्रा, (eo) μl)। , एनएम डब्ल्यू एफ वाई एच सी एम आर क्यू एन ई डी एन * + सी * पीएस जहां एस सी * + एन * (-एनएच + -) पेप्टाइड समूहों के योग के वर्णक्रमीय गुणांक हैं, एस पीएस पेप्टाइड बॉन्ड का अवशोषण है। पेप्टाइड्स की वर्णक्रमीय विशेषताओं को उनके क्रोमैटोग्राफिक चोटियों के क्षेत्र के रूप में C = 1 mM और 4 μL की एक नमूना मात्रा की गणना समीकरण द्वारा की गई थी: a पेप्टाइड = a N * + C * + (m-1) a PS + ai (9) जहां m पेप्टाइड में अमीनो एसिड अवशेषों की कुल संख्या है, a N * + C * पेप्टाइड के अंतिम समूहों का सशर्त शिखर क्षेत्र है, और λ PS है तरंग दैर्ध्य पर पेप्टाइड बंधन का विशिष्ट अवशोषण, एआई तरंग दैर्ध्य के लिए अमीनो एसिड अवशेषों की वर्णक्रमीय विशेषताएं हैं। समीकरण (9) में शामिल मान निम्नानुसार प्राप्त किए गए थे। हमने पेप्टाइड्स के संरचनात्मक तत्वों की विशिष्ट वर्णक्रमीय विशेषताओं की गणना = 210 एनएम (а 210 i) के तरंग दैर्ध्य पर की है, जो कि उनके क्रोमैटोग्राफिक चोटियों के क्षेत्रों के रूप में 1 मिमी की एकाग्रता और 4 μl के नमूना मात्रा के साथ समाधान के लिए है। समीकरण: a 210 i = a 210 AA a 210 N * + C *, (10) जहां 210 AA अमीनो एसिड का शिखर क्षेत्र है; पेप्टाइड के अंतिम समूहों का 210 एन * + सी * सशर्त शिखर क्षेत्र। 210 N * + C * मान को 210 Leu के बराबर लिया गया, क्योंकि NH 2 समूह nm तरंग दैर्ध्य रेंज में केवल Leu क्रोमोफोर हैं। 17

18 पेप्टाइड बॉन्ड (एक 210 पीएस) के विशिष्ट अवशोषण की गणना पेप्टाइड्स जीजीजी और जीजी के विशिष्ट अवशोषण के बीच अंतर के रूप में की गई थी: 210 पीएस = एक जीजीजी जीजी (11) तरंग दैर्ध्य के लिए वर्णक्रमीय विशेषताओं की गणना समीकरण का उपयोग करके की गई थी: a i = a 210 i (S / S 210), (12) जहां S / S 210 अमीनो एसिड और पेप्टाइड्स GG और GGG के वर्णक्रमीय अनुपात हैं, जो λ तरंग दैर्ध्य पर शिखर क्षेत्रों के अनुपात हैं। = 210 एनएम पर शिखर क्षेत्र । तालिका 7 प्रयोगात्मक रूप से प्राप्त किए गए 28 पेप्टाइड्स के लिए गणना किए गए वर्णक्रमीय अनुपात एस / एस 210 की तुलना दिखाती है। पेप्टाइड्स के प्रयोगात्मक रूप से प्राप्त और परिकलित वर्णक्रमीय अनुपात एक दूसरे के साथ अच्छे समझौते में हैं। ज्यादातर मामलों में, अंतर 0.06 से अधिक नहीं है। कुछ पेप्टाइड्स (5, 9, 12, 16, 18, 22, 23, 26, 27) के लिए, अनुमानित और प्रयोगात्मक वर्णक्रमीय अनुपात के बीच अधिक ध्यान देने योग्य अंतर देखे गए हैं। इन अंतरों के कारणों के लिए अतिरिक्त शोध की आवश्यकता है। तालिका 7. पेप्टाइड्स के वर्णक्रमीय अनुपात के प्रयोगात्मक और परिकलित मूल्यों की तुलना। पेप्टाइड वैल्यू स्पेक्ट्रल अनुपात एस / एस 210 तरंग दैर्ध्य (एनएम) के लिए: उप पूर्व उप पूर्व उप पूर्व उप उप पूर्व उप उप पूर्व उप उप उप उप उप उप

19 पेप्टाइड मान वर्णक्रमीय अनुपात एस / एस 210 तरंग दैर्ध्य (एनएम) के लिए: उप पूर्व उप पूर्व उप पूर्व उप पूर्व उप उप पूर्व उप उप पूर्व उप उप उप उप उप उप उप उप उप उप उप उप उप पूर्व उप पूर्व उप पूर्व उप पूर्व व्याच एक्सप्रेस व्याच एक्सप्रेस

20 पेप्टाइड मान वर्णक्रमीय अनुपात S / S 210 तरंग दैर्ध्य (nm) के लिए: Sub Ex Sub Ex. पेप्टाइड्स के मिश्रण के पृथक्करण से संबंधित अध्ययनों में उपयोगी हो सकता है। बीस

5. निष्कर्ष 1. एक ऐसी विधि विकसित की गई है जो एक मिलिक्रोम ए-02 क्रोमैटोग्राफ पर ग्रेडिएंट आरपी एचपीएलसी के मोड में ज्ञात संरचना के पेप्टाइड्स की अवधारण मात्रा की भविष्यवाणी करने की अनुमति देती है, जो पृथक अंशों के प्रत्यक्ष इंजेक्शन के लिए उपयुक्त अस्थिर मोबाइल चरण का उपयोग करती है। एक मास स्पेक्ट्रोमीटर में। 2. पेप्टाइड्स के पृथक्करण के लिए उपयोग किए जाने वाले मोबाइल चरण में 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280 और 300 एनएम के तरंग दैर्ध्य पर पेप्टाइड्स के ऑप्टिकल अवशोषण की गणना के लिए एक विधि विकसित की गई है। 3. विकसित विधियों का परीक्षण 28 मॉडल पेप्टाइड्स के लिए किया गया था। संबंधित प्रायोगिक मूल्यों के साथ परिकलित अवधारण मात्रा का सहसंबंध गुणांक 0.96 था। गणना और प्रयोगात्मक रूप से प्राप्त वर्णक्रमीय अनुपात एस / एस 210 के बीच विसंगति 0 से अधिक नहीं थी, संदर्भ 1. वीए रेजनिकोव, वीडी शिंगर्ट्स। अमीनो अम्ल। नोवोसिबिर्स्क: एनएसयू, एस। डॉसन आर।, इलियट डी।, इलियट डब्ल्यू।, जोन्स के। बायोकेमिस्ट्स हैंडबुक। मॉस्को: मीर, पी। 3. ओविचिनिकोव यू.ए. जैविक रसायन। मॉस्को: शिक्षा, पी। 4. जैव रसायन में उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एड। हेन्सन ए।)। मॉस्को।: मीर, पी। 5. नम्र जे.एल. // प्रोक। नेटल। एकेड। विज्ञान अमेरीका। 1980, वी। 77. नंबर 3। पी सकामोटो वाई।, कावाकामी एन।, ससागावा टी। // जे। क्रोमैटोग्र वी पी ससागावा टी।, ओकुयामा टी।, टेलर डी.सी. // जे। क्रोमैटोग्र वी पी ब्राउन सी। ए।, बेनेट एच। पी। जे।, सोलोमन एस। // गुदा। बायोकेम वी.124. पी मीक जे.एल., रोसेटी जेड.एल. // जे। क्रोमैटोगर वी पी अजारोवा आई.एन., बारम जी.आई., गोल्डबर्ग ई.एल. // बायोऑर्गेनिक केमिस्ट्री। प्रेस में। 11. यूवी-अवशोषित पदार्थों की बड़े पैमाने पर एकाग्रता। उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा माप प्रदर्शन करने की तकनीक। एफआर इरकुत्स्क

22 7. परिशिष्ट प्रायोगिक (ए) और परिकलित (बी) 11 पेप्टाइड्स के मिश्रण के क्रोमैटोग्राम। तालिका ए के अनुसार पेप्टाइड संख्या 0.5 यूपी एनएम बी एनएम वॉल्यूम, μl

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पेप्टाइड्स, प्राकृतिक या सिंथेटिक। कॉम।, जिसके अणु पेप्टाइड (एमाइड) बांड सी (ओ) एनएच द्वारा परस्पर जुड़े हुए अमीनो एसिड के अवशेषों से बने होते हैं। उनमें अणु में एक गैर-एमिनो एसिड घटक भी हो सकता है (उदाहरण के लिए, एक कार्बोहाइड्रेट अवशेष)। पेप्टाइड अणुओं में शामिल अमीनो एसिड अवशेषों की संख्या से, डि-पेप्टाइड्स, ट्रिपेप्टाइड्स, टेट्रापेप्टाइड्स आदि प्रतिष्ठित हैं। 10 अमीनो एसिड अवशेषों वाले पेप्टाइड्स कहलाते हैं। पॉलीपेप्टाइड्स के साथ 10 से अधिक अमीनो एसिड अवशेषों वाले ओलिगोपेप्टाइड्स एक मोल के साथ पीर पॉलीपेप्टाइड्स। मी. 6 हजार से अधिक। प्रोटीन

इतिहास संदर्भ।पहली बार, पेप्टाइड्स को एंजाइमैटिक प्रोटीन हाइड्रोलिसेट्स से अलग किया गया था। "पेप्टाइड्स" शब्द का प्रस्ताव ई. फिशर ने किया था। पहला सिंथेटिक पेप्टाइड 1881 में टी। कर्टियस द्वारा प्राप्त किया गया था, ई। फिशर ने 1905 तक पहला विकसित किया था सामान्य विधिपेप्टाइड्स का संश्लेषण और कई ऑलिगोपेप्टाइड्स डीकंप को संश्लेषित किया। इमारतें। जीव। ई। फिशर के छात्रों ई। एबडरगाल्डेन, जी। लेइक और एम। बर्गमैन ने पेप्टाइड रसायन विज्ञान के विकास में योगदान दिया। 1932 में, एम बर्गमैन और एल। ज़र्वस ने अमीनो एसिड के α-एमिनो समूहों की रक्षा के लिए पेप्टाइड्स के संश्लेषण में बेंज़िलोक्सीकार्बोनिल समूह (कार्बोबेंज़ॉक्सी समूह) का उपयोग किया, जिसने पेप्टाइड संश्लेषण के विकास में एक नया चरण चिह्नित किया। प्राप्त एन-संरक्षित अमीनो एसिड (एन-कार्बोबेंज़ोक्सीमिनो एसिड) का व्यापक रूप से विभिन्न पेप्टाइड्स प्राप्त करने के लिए उपयोग किया गया था, जो कि इन बीबी के रसायन विज्ञान और जैव रसायन की कई प्रमुख समस्याओं का अध्ययन करने के लिए सफलतापूर्वक उपयोग किया गया था, उदाहरण के लिए, सब्सट्रेट विशिष्टता का अध्ययन करने के लिए। प्रोटीयोलाइटिक एंजाइम। प्राकृतिक पेप्टाइड्स (ग्लूटाथियोन, कार्नोसिन, आदि) को पहली बार एन-कार्बोबेंज़ोक्साइमिनो एसिड के उपयोग से संश्लेषित किया गया था। इस क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण उपलब्धि शुरुआत में विकसित हुई। 50 के दशक पी। वॉन एट अल। मिश्रित एनहाइड्राइड द्वारा पेप्टाइड संश्लेषण (पेप्टाइड संश्लेषण की विधियों पर नीचे विस्तार से चर्चा की गई है)। 1953 में वी. डु विग्नो ने पहले पेप्टाइड हार्मोन, ऑक्सीटोसिन को संश्लेषित किया। 1963 में P. Merrifield द्वारा विकसित ठोस-चरण पेप्टाइड संश्लेषण की अवधारणा के आधार पर, स्वचालित रूप से बनाए गए थे। पेप्टाइड सिंथेसाइज़र। पेप्टाइड्स के नियंत्रित एंजाइमेटिक संश्लेषण के तरीकों को गहन रूप से विकसित किया गया है। नई विधियों के उपयोग ने हार्मोन इंसुलिन आदि के संश्लेषण को संभव बनाया।

उपलब्धियां सिंथेटिक। पेप्टाइड्स के रसायन विज्ञान को पेप्टाइड्स के पृथक्करण, शुद्धिकरण और विश्लेषण के तरीकों के विकास में प्रगति द्वारा तैयार किया गया था, जैसे कि आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी, दिसंबर के लिए वैद्युतकणसंचलन। वाहक, जेल निस्पंदन, उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी), इम्यूनोकेम। विश्लेषण और अन्य।अंत समूहों के विश्लेषण के लिए तरीके और पेप्टाइड्स के चरणबद्ध दरार के तरीकों को भी बहुत विकसित किया गया है। विशेष रूप से, स्वचालित रूप से बनाए गए थे। अमीनो एसिड विश्लेषक और स्वचालित पेप्टाइड्स की प्राथमिक संरचना का निर्धारण करने के लिए उपकरण, तथाकथित। अनुक्रमक

पेप्टाइड्स का नामकरण।मुक्त ले जाने वाले पेप्टाइड्स के अमीनो एसिड अवशेष। ए-एमिनो समूह, कहा जाता है। एन-टर्मिनल, और असर मुक्त है। ए-कार्बोक्सिल समूह - सी-टर्मिनल। पेप्टाइड छवि का नामनाम से हुआ है। इसके घटक अमीनो एसिड अवशेष, एन-टर्मिनल से शुरू होकर क्रमिक रूप से सूचीबद्ध हैं। इस मामले में, तुच्छ नामों का उपयोग किया जाता है। अमीनो एसिड, जिसमें अंत "इन" को "गाद" से बदल दिया जाता है; सी-टर्मिनल अवशेष, नाम का बहिष्करण। to-rogo नाम के साथ मेल खाता है। संबंधित अमीनो एसिड। पेप्टाइड्स में शामिल सभी अमीनो एसिड अवशेषों को एन-टर्मिनस से शुरू करके क्रमांकित किया जाता है। पेप्टाइड्स (एमिनो एसिड अनुक्रम) की प्राथमिक संरचना को रिकॉर्ड करने के लिए, अमीनो एसिड अवशेषों के तीन-अक्षर और एक-अक्षर वाले पदनामों का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है (उदाहरण के लिए, अला सेर-एस्प फे-जीआई अलनील-सेरिल-एस्पैरागिल-फेनिलएलनाइल-ग्लाइसिन)।

संरचना।पेप्टाइड बॉन्ड में आंशिक रूप से डबल बॉन्ड होता है। यह साधारण सी एन बांड (0.147 एनएम) की लंबाई की तुलना में इस बंधन (0.132 एनएम) की लंबाई में कमी में प्रकट होता है। पेप्टाइड बॉन्ड की आंशिक रूप से दोगुनी जुड़ी हुई प्रकृति इसे मुक्त करना असंभव बनाती है। इसके चारों ओर deputies के रोटेशन। इसलिए, पेप्टाइड समूह सपाट होता है और इसमें आमतौर पर एक ट्रांस-कॉन्फ़िगरेशन (f-la I) होता है। टी. एआर।, पेप्टाइड श्रृंखला की रीढ़ की हड्डी कठोर विमानों की एक श्रृंखला है जिसमें एक चल ("काज") आर्टिक्यूलेशन होता है जहां असममित होता है। परमाणु C (f-le I में तारांकन चिह्न द्वारा दर्शाया गया है)।

पेप्टाइड्स के समाधान में, कुछ कन्फर्मर्स का पसंदीदा गठन देखा जाता है। श्रृंखला को लंबा करने के साथ, माध्यमिक संरचना (ए-हेलिक्स और बी-स्ट्रक्चर) के आदेशित तत्व अधिक स्पष्ट प्रतिरोध (प्रोटीन के समान) प्राप्त करते हैं। एक माध्यमिक संरचना का गठन विशेष रूप से नियमित पेप्टाइड्स की विशेषता है, विशेष रूप से पॉलीएमिनो एसिड के लिए।

गुण। ओलिगोपेप्टाइड्स अमीनो एसिड के करीब हैं, पॉलीपेप्टाइड्स प्रोटीन के समान हैं। ओलिगोपेप्टाइड आमतौर पर क्रिस्टलीय होते हैं। इन-द्वीपों, गर्मी के तहत विघटित। 200 300 0 सी तक। वे अच्छी तरह से घुलनशील हैं। पानी में, डिल। to-takh और क्षार, लगभग कोई सोल नहीं। संगठन में पी-शौकिया। बहिष्करण ओलिगोपेप्टाइड हाइड्रोफोबिक अमीनो एसिड अवशेषों से निर्मित।

ओलिगोपेप्टाइड्स में एम्फ़ोटेरिक गुण होते हैं और, माध्यम की अम्लता के आधार पर, धनायनों, आयनों या ज़्विटेरियन के रूप में मौजूद हो सकते हैं। मुख्य एनएच समूह 3300 और 3080 सेमी -1 के लिए आईआर स्पेक्ट्रम में अवशोषण बैंड, सी = ओ समूह 1660 सेमी -1 के लिए। यूवी स्पेक्ट्रम में, पेप्टाइड समूह का अवशोषण बैंड 180-230 एनएम के क्षेत्र में होता है। समविद्युतविभव पेप्टाइड्स का बिंदु (pI) व्यापक रूप से भिन्न होता है और अणु में अमीनो एसिड अवशेषों की संरचना पर निर्भर करता है। pK पेप्टाइड्स के लिए एक मान लगभग हैं। 3, ए -एन एच 2 के लिए लगभग। आठ।

रसायन। ओलिगोपेप्टाइड्स के पवित्र द्वीप उनमें निहित फंक द्वारा निर्धारित किए जाते हैं। समूह, साथ ही पेप्टाइड बांड की विशेषताएं। उनका रसायन। साधनों में परिवर्तन। कम से कम अमीनो एसिड के संबंधित p-tions के समान। डाल देते हैं। बायोरेट प्रतिक्रिया और निनहाइड्रिन प्रतिक्रिया। डाइपेप्टाइड्स और उनके डेरिवेटिव (विशेष रूप से एस्टर) आसानी से चक्रित होते हैं, डाइकेटोपाइपरजाइन्स में परिवर्तित होते हैं। 5.7 एन के प्रभाव में।

हाइड्रोक्लोरिक एसिड पेप्टाइड्स 24 घंटे के भीतर 105 0 C पर अमीनो एसिड में हाइड्रोलाइज्ड हो जाते हैं।

संश्लेषण।रसायन। पेप्टाइड संश्लेषण में एक अमीनो एसिड के COOH समूह और दूसरे अमीनो एसिड या पेप्टाइड के NH 2 के बीच एक पेप्टाइड बॉन्ड बनाना शामिल है। इसके अनुसार, पेप्टाइड संश्लेषण समाधान के कार्बोक्सिल और अमाइन घटकों को प्रतिष्ठित किया जाता है। पेप्टाइड्स का लक्षित नियंत्रित संश्लेषण करने के लिए, प्रारंभिक आवश्यक है। सभी (या कुछ) कार्यों की अस्थायी सुरक्षा। समूह, टू-राई पेप्टाइड बॉन्ड के निर्माण में भाग नहीं लेते हैं, और प्रारंभिक रूप से भी। पेप्टाइड संश्लेषण के घटकों में से एक की सक्रियता। संश्लेषण के अंत के बाद, सुरक्षात्मक समूहों को हटा दिया जाता है। जैविक रूप से सक्रिय पेप्टाइड्स प्राप्त करते समय, पेप्टाइड संश्लेषण के सभी चरणों में अमीनो एसिड के रेसमाइज़ेशन की रोकथाम एक शर्त है।

नायब। सक्रियण के p-re-विधियों में p-tions के कार्यान्वयन में पेप्टाइड बांड के गठन के महत्वपूर्ण तरीके। ईथर, कार्बोडाइमाइड, मिश्रित एनहाइड्राइड और एजाइड विधि।

सक्रिय एस्टर की विधि पूर्व पर आधारित है। कार्बोक्सिल घटक के एस्टर व्युत्पन्न का निर्माण इसमें एक अल्कोहल अवशेष को पेश करके एक मजबूत इलेक्ट्रॉन-निकालने वाला पदार्थ होता है। नतीजतन, एक अत्यधिक प्रतिक्रियाशील एस्टर बनता है, जो पेप्टाइड संश्लेषण के अमीनो घटक की कार्रवाई के तहत आसानी से अमीनोलिसिस से गुजरता है। उत्प्रेरक के रूप में। पेप्टाइड्स के संश्लेषण में एस्टर व्यापक रूप से पेंटा-फ्लोरो-, पेंटाक्लोरो-, ट्राइक्लोरो- और एन-नाइट्रोफिनाइल और संरक्षित अमीनो एसिड और पेप्टाइड्स के कई अन्य एस्टर का उपयोग किया जाता है।

पेप्टाइड बांड निर्माण की कार्बोडीमाइड विधि में डीकंप का उपयोग शामिल है संघनक अभिकर्मकों के रूप में। प्रतिस्थापित कार्बोडायमाइड्स। डायसाइक्लोहेक्सिल-कार्बोडायमाइड विशेष रूप से पेप्टाइड्स के संश्लेषण में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है:

एक्स और वाई-रेस्प। एन- और सी-सुरक्षात्मक समूह इस संघनक अभिकर्मक के साथ, जलीय मीडिया में पेप्टाइड्स के संश्लेषण को अंजाम देना संभव है, क्योंकि मध्यवर्ती ओ-एसिलिसोमोचेविन (II) के हाइड्रोलिसिस और अमीनोलिसिस की दरें काफी भिन्न हैं। पेप्टाइड्स के संश्लेषण में, डीकंप का भी उपयोग किया जाता है। पानी में घुलनशील कार्बोडीमाइड्स (जैसे एन-डाइमिथाइलामिनोप्रोपाइल-एन "-एथिलकार्बोडायमाइड)।

मिश्रित एनहाइड्राइड विधि पूर्व पर आधारित है। कार्बोक्जिलिक या अकार्बनिक एनहाइड्राइड के साथ मिश्रित एनहाइड्राइड के गठन से पेप्टाइड संश्लेषण के कार्बोक्सिल घटक की सक्रियता। उस से। नायब। अक्सर आप के लिए क्लोरोफॉर्मिक (क्लोरोकार्बन) के एल्काइल ईथर का उपयोग करते हैं, विशेष रूप से एथिल और आइसोबुटिल ईथर, उदाहरण के लिए:

बी - तृतीयक अमीन

इस विधि से पेप्टाइड्स को संश्लेषित करते समय, एन-एसाइल एमिनो एसिड और पाइवलिक (ट्राइमेथाइलैसेटिक) के मिश्रित एनहाइड्राइड्स बहुत प्रभावी होते हैं। मजबूत के लिए धन्यवाद, वह इसे नीचे रख देगा। टर्ट-ब्यूटाइल समूह के आगमनात्मक प्रभाव के कारण, पाइवलिक एसिड के शेष भाग में कार्बोक्सिल परमाणु सी की इलेक्ट्रोफिलिसिटी काफी कम हो जाती है, और यह, स्टेरिच के साथ। बाधाओं, अवांछित दबा देता है। urethane और मुक्त के गठन का पक्ष जिला। एन-एसिलामिनो एसिड, किनारों को योजना के अनुसार किया जाता है:

मिश्रित एनहाइड्राइड विधि के एक अवतार में, 1-एथोक्सीकार्बोनिल-2-एथोक्सी-1,2-डायहाइड्रोक्विनोलिन का उपयोग संघनक एजेंट के रूप में किया जाता है। यह एक कनेक्शन है। आसानी से पेप्टाइड संश्लेषण के कार्बोक्सिल घटक के साथ एक मध्यवर्ती बनाता है। मिश्रित एनहाइड्राइड, संक्षेपण के पी-टियन में जल्दी से प्रवेश कर रहा है, और पूरी तरह से अवांछनीय को बाहर रखा गया है। पार्श्व जिला।

मिश्रित एनहाइड्राइड विधि का एक विशेष मामला सममित विधि है। एनहाइड्राइड, जिसमें अमीनो एसिड 2 ओ के एनहाइड्राइड का उपयोग किया जाता है। उनके उपयोग में अनुपातहीनता या गलत अमीनोलिसिस की संभावना शामिल नहीं है।

संश्लेषण की एजाइड विधि कार्बोक्सिल घटक के सक्रियण के लिए इसे एन-प्रतिस्थापित अमीनो एसिड या पेप्टाइड के एजाइड में परिवर्तित करके प्रदान करती है:

मुक्त में उनके azides की अस्थिरता के कारण। समाधान का रूप, एक नियम के रूप में, पृथक नहीं है। यदि, हाइड्राज़ाइड के साथ पी-टियन के लिए क्षार धातु नाइट्राइट के बजाय, नाइट्रोजनस टू-यू (उदाहरण के लिए, टर्ट-ब्यूटाइल नाइट्राइट) के अल्काइल ईथर का उपयोग करें, तो एज़ाइड संघनन को ऑर्ग में किया जा सकता है। पी-परीक्षक; परिणामी HN 3 तृतीयक ऐमीन के साथ युग्मित होता है। अक्सर, azide संक्षेपण अवांछनीय है। साइड पी-टियंस (हाइड्राजाइड को एज़ाइड में नहीं, बल्कि एमाइड में परिवर्तित करना; पी-टियोन)एज़ाइड के साथ हाइड्राज़ाइड, जिससे 1,2-डायसिल-हाइड्राज़िन का निर्माण होता है; अवधि में। कर्टियस की पुनर्व्यवस्था के परिणामस्वरूप एक आइसोसाइनेट, टू-री के गठन से यूरिया या संबंधित urethane, आदि का व्युत्पन्न हो सकता है)। एज़ाइड विधि के फायदे रेसमाइज़ेशन की कम डिग्री हैं, हाइड्रॉक्सिल समूहों की सुरक्षा के बिना सेरीन और थ्रेओनीन का उपयोग करने की संभावना।

मोड़ के लिए। मुक्त उपयोग विशेष में संरक्षित पेप्टाइड्स। डीब्लॉकिंग के तरीके, टू-राई पी-टियन पर आधारित हैं, जो डीकंप को विभाजित करने की सुविधा प्रदान करते हैं। सुरक्षात्मक समूह जो अणु में सभी पेप्टाइड बांडों के संरक्षण की गारंटी देते हैं। डीब्लॉकिंग उदाहरण: बेंजाइल ऑक्सीकार्बोनिल समूह उत्प्रेरक को हटाना। एटीएम पर हाइड्रोजनोलिसिस। दबाव और कमरे का तापमान, हल्के एसिडोलिसिस द्वारा टर्ट-ब्यूटाइलॉक्सीकार्बोनिल समूह की दरार, साथ ही हाइड्रोलाइटिक। तनु की क्रिया के तहत ट्राइफ्लोरोएसिटाइल समूह की दरार। आधारों का समाधान।

जैविक रूप से सक्रिय पेप्टाइड्स को संश्लेषित करते समय, यह महत्वपूर्ण है कि रेसमाइज़ेशन न हो, जिसे सी एन-एसिलामिनो एसिड या पेप्टाइड के ए-परमाणु से एच + के प्रतिवर्ती दरार के परिणामस्वरूप किया जा सकता है। बेस और टू-यू रेसमाइज़ेशन में योगदान करते हैं, उच्च टी-आरएऔर ध्रुवीय पी-रिसीवर। निर्णायक भूमिका रेसमाइज़ेशन द्वारा निभाई जाती है, जो आधारों द्वारा उत्प्रेरित होती है, किनारों को तथाकथित पर आगे बढ़ाया जा सकता है। एज़्लैक्टोन तंत्र या योजना के अनुसार एनोलिज़ेशन के माध्यम से:

नायब। रेसमाइज़ेशन से बचने के महत्वपूर्ण तरीके: 1) सी-टर्मिनस से एन-टर्मिनस की दिशा में पेप्टाइड श्रृंखला का विस्तारआरओसी (ओ) प्रकार के एन-सुरक्षात्मक समूहों के उपयोग के साथ। 2) सी-टर्मिनल प्रोलाइन या ग्लाइसिन अवशेषों के साथ एन-संरक्षित पेप्टाइड अंशों का सक्रियण। 3) एजाइड विधि का उपयोग (तृतीयक आधार की अधिकता के अभाव में और प्रतिक्रिया माध्यम में कम तापमान बनाए रखना)। 4) उत्प्रेरक का अनुप्रयोग। अमीनो एसिड के एस्टर, टू-रिख एमिनोलिसिस एक संक्रमण अवस्था के माध्यम से आगे बढ़ते हैं, स्थिर होते हैं। हाइड्रोजन ब्रिज (उदाहरण के लिए, एन-हाइड्रॉक्सीपाइपरिडाइन और 8-हाइड्रॉक्सीक्विनोलिन से बने एस्टर)। 5) एन-हाइड्रॉक्सीसाइड के साथ कार्बोडीमाइड विधि का उपयोग। या टू-टी लुईस।

समाधान में पेप्टाइड्स के संश्लेषण के साथ, अघुलनशील वाहकों का उपयोग करके पेप्टाइड्स के संश्लेषण का बहुत महत्व है। इसमें पेप्टाइड्स का ठोस-चरण संश्लेषण (पी-टियन, या विधि, मेर-रिफिल्ड) और पॉलीमेरिक अभिकर्मकों का उपयोग करके पेप्टाइड्स का संश्लेषण शामिल है।

ठोस-चरण पेप्टाइड संश्लेषण की रणनीति एक अघुलनशील बहुलक वाहक पर संश्लेषित पेप्टाइड श्रृंखला के अस्थायी निर्धारण के लिए प्रदान करती है और निम्नलिखित योजना के अनुसार की जाती है:

इस पद्धति के लिए धन्यवाद, अंतर को अलग करने और साफ करने के लिए बहुत जटिल और समय लेने वाली प्रक्रियाओं को बदलना संभव था। सरल धुलाई और निस्पंदन संचालन द्वारा पेप्टाइड्स, साथ ही पेप्टाइड संश्लेषण की प्रक्रिया को समय-समय पर दोहराई जाने वाली प्रक्रियाओं के मानक अनुक्रम में कम करने के लिए, आसानी से स्वचालन के लिए उत्तरदायी। मेरिफिल्ड की विधि ने पेप्टाइड संश्लेषण की प्रक्रिया को काफी तेज करना संभव बना दिया। इस पद्धति के आधार पर, डीकंप। प्रकार स्वचालित पेप्टाइड सिंथेसाइज़र।

उच्च प्रदर्शन कनेक्शन प्रारंभिक एचपीएलसी की अलग क्षमताओं के साथ पेप्टाइड्स का ठोस-चरण संश्लेषण रसायन के गुणात्मक रूप से नए स्तर तक पहुंच प्रदान करता है। पेप्टाइड्स का संश्लेषण, जो बदले में, डीकंप के विकास पर लाभकारी प्रभाव डालता है। जैव रसायन के क्षेत्र, वे कहते हैं। जीव विज्ञान, आनुवंशिक इंजीनियरिंग, जैव प्रौद्योगिकी, औषध विज्ञान और चिकित्सा।

पॉलीमेरिक अभिकर्मकों का उपयोग करके पेप्टाइड्स के संश्लेषण की रणनीति एक उच्च मोल के लिए एक अस्थायी बंधन प्रदान करती है। वाहक उत्प्रेरक। एक कार्बोक्सिल घटक या एक पेप्टाइड संश्लेषण संघनक एजेंट। इस विधि का लाभ: बहुलक के लिए तय किए गए अभिकर्मकों को अधिक मात्रा में जोड़ा जा सकता है, और संश्लेषित पेप्टाइड्स को अघुलनशील पॉलिमर से अलग करना मुश्किल नहीं है।

इस तरह के संश्लेषण का एक उदाहरण एक दिए गए अनुक्रम में कई के माध्यम से एक एमिनो घटक का मार्ग है। स्तंभ, जिनमें से प्रत्येक में एक बहुलक बाध्य होता है

पांडुलिपि के रूप में

मेलनिकोव इगोर ओलेगोविच

अमीनो एसिड के विश्लेषण के लिए सूक्ष्म तरीकों का विकास,

लघु पेप्टाइड्स और ओलिगोनक्लियोटाइड्स

आरपी एचपीएलसी और केशिका का उपयोग करना

वैद्युतकणसंचलन

विशेषता: 02.00.02 - विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान

रसायन विज्ञान के उम्मीदवार की डिग्री के लिए निबंध

मॉस्को स्टेट एकेडमी ऑफ फाइन केमिकल टेक्नोलॉजी के विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान विभाग में MOSCOW 2006 निबंध कार्य का नाम रखा गया है

एम.वी. लोमोनोसोव और इंस्टीट्यूट ऑफ बायोऑर्गेनिक केमिस्ट्री के प्रोटीन के विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान के नाम पर रखा गया शिक्षाविद एम.एम. शेम्याकिन और यू.ए. ओविचिनिकोव आरएएस।

वैज्ञानिक सलाहकार:

रासायनिक विज्ञान के उम्मीदवार, एसोसिएट प्रोफेसर ग्लुबोकोव यूरी मिखाइलोविच

आधिकारिक विरोधियों:

रासायनिक विज्ञान के डॉक्टर, प्रोफेसर मकारोव निकोले वासिलिविच रासायनिक विज्ञान के उम्मीदवार किरिलोवा यूलिया गेनाडिवना

अग्रणी संगठन:

जैव संस्थान रासायनिक भौतिकीउन्हें। एन.एम. इमानुएल रासो

रक्षा 20 दिसंबर, 2006 को 12:00 बजे मॉस्को स्टेट एकेडमी ऑफ फाइन केमिकल टेक्नोलॉजी में निबंध परिषद डी 212.120.05 की बैठक में होगी। एम.वी. पते पर लोमोनोसोव: 119571, मॉस्को, वर्नाडस्की संभावना, 86, कमरा एम-119.

शोध प्रबंध मास्को स्टेट एकेडमी ऑफ फाइन केमिकल टेक्नोलॉजी के पुस्तकालय में पाया जा सकता है जिसका नाम वी.आई. एम.वी. लोमोनोसोव।

निबंध परिषद के वैज्ञानिक सचिव, रसायन विज्ञान के उम्मीदवार यू.ए. एफ़िमोवा प्रासंगिकताकाम। वर्तमान में, नैदानिक ​​अनुसंधान तेजी से सबसे आम और खतरनाक सामाजिक रूप से महत्वपूर्ण बीमारियों के निदान के लिए विश्लेषण के वाद्य सूक्ष्म तरीकों के उपयोग पर केंद्रित है। इन विधियों का एक महत्वपूर्ण हिस्सा पूरी तरह से नहीं है और हमेशा उनका समय पर और उच्च गुणवत्ता वाला निदान प्रदान नहीं करता है, जो अक्सर किसी व्यक्ति की जैव रासायनिक स्थिति की निगरानी के लिए आधुनिक आवश्यकताओं को पूरा नहीं करता है।

शारीरिक तरल पदार्थों में मुक्त अमीनो एसिड और लघु पेप्टाइड्स का अत्यधिक कार्यात्मक महत्व है। कुछ मामलों में, वे कुछ बीमारियों के आणविक मार्कर के रूप में कार्य कर सकते हैं।

उनकी एकाग्रता में परिवर्तन अक्सर चयापचय संबंधी विकारों से जुड़े होते हैं, जो किसी विशेष बीमारी के विकास का संकेत देते हैं। अमीनो एसिड विश्लेषण के अधिकांश मौजूदा तरीके या तो अपर्याप्त रूप से संवेदनशील और उनकी पहचान के लिए चयनात्मक हैं, या अमीनो एसिड के व्युत्पन्नकरण की आवश्यकता होती है, जो उनके निर्धारण की प्रक्रिया को काफी जटिल करता है। मुक्त आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड अमीनो एसिड के सरल और किफायती विश्लेषण की समस्या अभी तक पूरी तरह से हल नहीं हुई है। उसी समय, अमीनो एसिड के नैदानिक ​​विश्लेषण के लिए अत्यधिक संवेदनशील और चयनात्मक निर्धारण के लिए उनके पूर्व या पोस्ट-कॉलम संशोधन की आवश्यकता होती है। शारीरिक तरल पदार्थों में आणविक मार्करों की सामग्री में परिवर्तन भी एक विशिष्ट बीमारी के लिए रोगी की आनुवंशिक प्रवृत्ति से जुड़ा हो सकता है। इसलिए, अध्ययन के तहत बीमारी के कारण और अधिक प्रभावी चिकित्सा के निर्धारण की विश्वसनीयता बढ़ाने के लिए डीएनए अंशों का तुलनात्मक विश्लेषण करना आवश्यक है।

इस बीच, अमीनो एसिड और न्यूक्लियोटाइड विश्लेषण के लिए आवश्यक आयातित उपकरण, एक नियम के रूप में, अधिकांश नैदानिक ​​प्रयोगशालाओं के लिए महंगा और दुर्गम है। स्थिति इस तथ्य से बढ़ जाती है कि प्रत्येक प्रकार की बीमारी के लिए कई उपकरण अत्यधिक विशिष्ट होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप उपकरण और कार्यप्रणाली दोनों के संदर्भ में नैदानिक ​​​​विधियों का एक से अधिक दोहराव होता है।

यह नाटकीय रूप से नैदानिक ​​परीक्षणों की लागत को बढ़ाता है और तुलना को जटिल बनाता है। आई.वी. लगातार मदद, ध्यान और परिणामों की चर्चा के लिए नाज़िमोव।

प्राप्त विश्लेषण के परिणाम। इस प्रकार, नए तरीकों का विकास जो कि बायोपॉलिमर और उनके टुकड़ों के संरचनात्मक विश्लेषण के लिए मुक्त और संशोधित अमीनो एसिड, शॉर्ट पेप्टाइड्स और ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के अत्यधिक संवेदनशील और विश्वसनीय निर्धारण के लिए घरेलू उत्पादन के सार्वजनिक रूप से उपलब्ध विश्लेषणात्मक उपकरणों के उपयोग की संभावनाओं का विस्तार करते हैं, और नैदानिक ​​नैदानिक ​​उद्देश्यों के लिए एक अत्यावश्यक वैज्ञानिक कार्य है। ...

उद्देश्य. उद्देश्यथीसिस घरेलू वाद्य आधार का उपयोग करके मुक्त और संशोधित अमीनो एसिड, लघु पेप्टाइड्स और ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के विश्लेषण के लिए अत्यधिक संवेदनशील माइक्रोमैथोड्स के एक जटिल का विकास है।

वैज्ञानिक नवीनता.

1. गैर-संशोधित आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड α-एमिनो एसिड के निर्धारण के लिए तरीके विकसित किए गए हैं, जो सीधे यूवी फोटोमेट्रिक और रेफ्रेक्टोमेट्रिक डिटेक्शन विधियों के साथ केशिका जोनल वैद्युतकणसंचलन और माइक्रेलर इलेक्ट्रोकेनेटिक क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करते हैं।

2. फ्लोरोमेट्रिक और प्रत्यक्ष यूवी फोटोमेट्रिक डिटेक्शन विधियों के साथ रिवर्स चरण उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी और केशिका क्षेत्र वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके रक्त प्लाज्मा में कम आणविक भार एमिनोथिओल्स के संयुक्त निर्धारण के लिए नैदानिक ​​अभ्यास विधियों में विकसित और लागू किया गया।

3. फ्लोरोमेट्रिक डिटेक्शन के साथ केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा एलील-विशिष्ट पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन के उत्पादों के विश्लेषण के आधार पर शिरापरक घनास्त्रता के उत्परिवर्ती जीन के टुकड़ों को निर्धारित करने के लिए एक विधि विकसित की गई है।

व्यवहारिक महत्व ... अमीनो एसिड विश्लेषण की विकसित विधि आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड अमीनो एसिड की ट्रेस मात्रा को उनके प्रारंभिक व्युत्पन्न किए बिना निर्धारित करना संभव बनाती है, जो मौजूदा विश्लेषण योजना को बहुत सरल करता है। संवहनी तबाही (होमोसिस्टीन, सिस्टीन, ग्लूटाथियोन) के आणविक मार्करों के विश्लेषण के लिए विधियों का एक जटिल, साथ ही शिरापरक घनास्त्रता के उत्परिवर्ती जीन के टुकड़े विकसित किए गए हैं और व्यावहारिक उपयोग के लिए प्रस्तावित किए गए हैं। किए गए कार्य के परिणामस्वरूप, केशिका वैद्युतकणसंचलन के लिए एक ही उपकरण पर प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड घटकों दोनों के जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए घरेलू उपकरणों के प्रभावी उपयोग की संभावना दिखाना संभव था। इस कार्य में विकसित विधि के अनुसार रक्त प्लाज्मा में सल्फर युक्त अमीनो एसिड और पेप्टाइड्स का निर्धारण मज़बूती से स्थापित रोधगलन और पूर्व रोधगलन राज्यों वाले दर्जनों रोगियों के जोखिम कारक का आकलन करने के लिए किया गया था। इस काम के परिणामों का उपयोग संस्थान में विकसित कुछ सामाजिक रूप से महत्वपूर्ण बीमारियों (दिल के दौरे, स्ट्रोक, घनास्त्रता) के आणविक निदान के लिए उपकरणों और विधियों के एक सार्वभौमिक किफायती स्वचालित परिसर के जैव चिकित्सा विश्लेषण के निर्माण और परीक्षण में किया गया था। रूसी विज्ञान अकादमी का विश्लेषणात्मक इंस्ट्रुमेंटेशन।

बचाव के लिए लाया जाता है:

केशिका क्षेत्र वैद्युतकणसंचलन और माइक्रेलर इलेक्ट्रोकेनेटिक क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके उनके प्रारंभिक व्युत्पन्नकरण के बिना जलीय घोल में आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड अमीनो एसिड का निर्धारण करने के तरीके;

फ्लोरोजेनिक अभिकर्मकों (मोनोब्रोमोबिमैन और 5-आयोडोएसिटामिडोफ्लोरेसिन) का उपयोग करके कम आणविक भार प्लाज्मा एमिनोथिओल्स के व्युत्पन्नकरण के लिए अनुकूलित स्थितियां;

आरपी एचपीएलसी और केशिका वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके रक्त प्लाज्मा के कम आणविक भार एमिनोथिओल्स के विश्लेषण की विधि;

आरपी एचपीएलसी और केशिका क्षेत्र वैद्युतकणसंचलन द्वारा रक्त प्लाज्मा में होमोसिस्टीन की सामग्री का निर्धारण करने के परिणाम;

रैखिक पॉली-एन, एन `डाइमिथाइलएक्रिलामाइड में केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके शिरापरक घनास्त्रता के एक उत्परिवर्ती जीन का निर्धारण करने के लिए एक विधि।

कार्य की स्वीकृति. मुख्य परिणामआणविक तरल क्रोमैटोग्राफी और केशिका वैद्युतकणसंचलन (अक्टूबर 15-19, 2001, मॉस्को, रूस) पर 8 वें अखिल रूसी संगोष्ठी में काम प्रस्तुत किए गए थे, बायोसाइंसेज में पृथक्करण विधियों पर तीसरा अंतर्राष्ट्रीय संगोष्ठी (13-18 मई, 2003, मास्को, रूस) , ), मौलिक विज्ञान में स्नातक और स्नातक छात्रों का अंतर्राष्ट्रीय सम्मेलन "लोमोनोसोव -2005" (अनुभाग रसायन विज्ञान। 12-15 अप्रैल, 2005, मॉस्को, रूस), दूसरा वैज्ञानिक-व्यावहारिक सम्मेलन "चिकित्सा जैव प्रौद्योगिकी की वास्तविक समस्याएं" (12 सितंबर- 14 2005, अनपा, रूस), रूस के जैव प्रौद्योगिकीविदों की सोसायटी की तीसरी कांग्रेस का नाम वी.आई. यू.ए. ओविचिनिकोव (25-27 अक्टूबर, 2005, मॉस्को, रूस), एम.वी. के युवा वैज्ञानिकों का पहला सम्मेलन। एम.वी. लोमोनोसोव (13-14 अक्टूबर, 2005, मॉस्को, रूस), विश्लेषणात्मक विज्ञान पर अंतर्राष्ट्रीय कांग्रेस आईसीएएस-2006 (25-30 जून, 2006, मॉस्को, रूस), यूरोपीय जैव रासायनिक समाज संघ की 31वीं अंतर्राष्ट्रीय कांग्रेस (24- 29 जून, इस्तांबुल, तुर्की), प्रोटीन, पेप्टाइड्स और पोलीन्यूक्लियोटाइड्स के पृथक्करण पर 26वां अंतर्राष्ट्रीय संगोष्ठी (अक्टूबर 16-20, 2006, इंसब्रुक, ऑस्ट्रिया)।

प्रकाशनों... शोध प्रबंध की सामग्री के आधार पर, लेख और रिपोर्ट के शोध के रूप में 12 कार्य प्रकाशित किए गए थे।

निबंध संरचना... शोध प्रबंध में एक परिचय, एक साहित्य समीक्षा, एक प्रयोगात्मक भाग, परिणामों की चर्चा, निष्कर्ष और उद्धृत साहित्य की एक सूची शामिल है।

शोध प्रबंध सामग्री 147 पृष्ठों पर प्रस्तुत की गई है, जिसमें 19 टेबल और 42 आंकड़े हैं। साहित्यिक स्रोतों की सूची में 187 शीर्षक हैं।

परिचय मेंविषय की पुष्टि दी गई है, अध्ययन के उद्देश्य और रक्षा के प्रावधान तैयार किए गए हैं, इसकी वैज्ञानिक नवीनता और व्यावहारिक महत्व को नोट किया गया है। शोध परिणामों के अनुमोदन और प्रकाशन के साथ-साथ थीसिस की संरचना और मात्रा पर डेटा दिया गया है।

पहला अध्याय। अध्ययन के तहत यौगिकों के विश्लेषण के मौजूदा तरीकों के बारे में सामान्य जानकारी प्रस्तुत की गई है। क्रोमैटोग्राफिक विधियों और कई पारंपरिक पहचान विधियों का अधिक विस्तार से वर्णन किया गया है। कम आणविक भार वाले रक्त प्लाज्मा एमिनोथिओल्स और डीएनए अंशों के निर्धारण के तरीकों पर विचार किया जाता है। अमीनो एसिड, शॉर्ट पेप्टाइड्स और ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के विश्लेषण के लिए मौजूदा तरीकों की तुलना की जाती है और इस क्षेत्र में आगे के शोध की प्रासंगिकता की पुष्टि की जाती है।

दूसरा अध्याय। सामग्री, अभिकर्मकों, प्रयुक्त समाधानों को तैयार करने के तरीके और कार्य प्रदर्शन पर डेटा दिया गया है।

तीसरा अध्याय। परिणाम और चर्चा।

शारीरिक तरल पदार्थों में मुक्त अमीनो एसिड (एए) की सामग्री कई बीमारियों के लिए एक नैदानिक ​​​​पैरामीटर है। किए गए शोध का उद्देश्य एक ऐसी कार्यप्रणाली विकसित करना है जो उन्हें जल्दी और मज़बूती से अलग करने और उनकी पहचान करने की अनुमति देती है। ऐसे एए के मिश्रण का विश्लेषण केशिका जोनल वैद्युतकणसंचलन (सीजेडई) और माइक्रेलर इलेक्ट्रोकेनेटिक क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके किया गया था।

ए) बफर: 60 एमएम सोडियम बोरेट, पीएच 11.0। वोल्टेज: 20 केवी। वर्तमान ताकत: 93 μA. तापमान: 21.0 डिग्री सेल्सियस पृष्ठभूमि की इष्टतम संरचना चुनाव ट्रोलाइट द्वारा पेश किया गया। ऐसा करने के लिए, एके की मात्रा - 0.1 एनजी; ऐलेनिन, टायरोसिन - 0.2 एनजी।

4 - प्रोलाइन; 5 - अलैनिन; 6 - टायरोसिन; 7 - सेरिन; - एस्पार्टिक अम्ल; 9 - मेथियोनीन।

सीएपीएस बफर सिस्टम, साथ ही विभिन्न प्रकृति और गुणों के कट्टरपंथी और एमिनो समूह के अधिकतम पीकेए मूल्यों के साथ 8 एए के मॉडल मिश्रण के उदाहरण पर उनके विभिन्न संयोजन। बोरेट पृष्ठभूमि इलेक्ट्रोलाइट का उपयोग करके इस तरह के मिश्रण को अलग करने का एक उदाहरण चित्र 1 में दिखाया गया है।

इस विधि द्वारा मुक्त एए के पृथक्करण के लिए इष्टतम सहायक इलेक्ट्रोलाइट 60 मिमी बोरेट बफर (पीएच 11.0) युक्त एक समाधान है।

इसके प्रयोग से का प्रभाव कई कारक(वोल्टेज, करंट, आंतरिक व्यास और केशिका की प्रभावी लंबाई, नमूना परिचय की विधि) पृथक्करण दक्षता पर और यह दिखाया गया कि प्रयोगात्मक परिस्थितियों में सभी एन्कोडेड एए के मिश्रण को पूरी तरह से अलग करना संभव नहीं था। यह प्रयोग से इस प्रकार है कि एए उचित रूप से अलग हो गए हैं, जिसके लिए प्रवासन समय में अंतर 1 मिनट से अधिक है। इस कारण से, शास्त्रीय CZE विधि को ग्लाइसीन, ऐलेनिन, वेलिन, ल्यूसीन, आइसोल्यूसीन, हिस्टिडाइन, फेनिलएलनिन और टायरोसिन, साथ ही एसपारटिक, ग्लूटामिक एसिड और सिस्टीन की संयुक्त उपस्थिति में अलग और पहचाना नहीं जा सकता है। उनके लिए चयनात्मकता गुणांक बहुत कम है और 1. के करीब है। आर्जिनिन, लाइसिन, प्रोलाइन, सेरीन, एसपारटिक एसिड और मेथियोनीन आसानी से अलग और पहचाने जाते हैं; 5.5-10.0, 15 और 19.5-20.8 मिनट के प्रवासन समय के साथ एके। AA के इस समूह के लिए चयनात्मकता गुणांक का मान 1.1 - 1.3 की सीमा में है। फॉस्फेट सपोर्टिंग इलेक्ट्रोलाइट (पीएच 11.4) का उपयोग करते समय, एक समान समग्र पृथक्करण पैटर्न देखा गया था, लेकिन खराब शिखर रिज़ॉल्यूशन के साथ। किए गए अध्ययनों से पता चलता है कि एक रेफ्रेक्टोमेट्रिक अंत के साथ शास्त्रीय सीजेडई, 8 एए से अधिक के जलीय घोल में पूर्ण पृथक्करण और पहचान करने की अनुमति देता है। इसी समय, इस तरह के मिश्रण में संकेतित अविभाज्य लोगों से अलग-अलग एए की सामग्री दो से अधिक नहीं होनी चाहिए।

एए पृथक्करण की दक्षता में उल्लेखनीय रूप से सुधार होता है जब मेथनॉल को पीएच 7 के साथ सहायक इलेक्ट्रोलाइट्स में जोड़ा जाता है। जब 150 मिमी फॉस्फेट बफर (पीएच 2.0) 30% वॉल्यूम के अतिरिक्त के साथ। मेथनॉल 20 में से 16 आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड एए (छवि 2) को अलग करने में सक्षम था। दुर्भाग्य से, इस मिश्रण को पूरी तरह से अलग होने में काफी समय लगता है।

केशिका: भीतरी व्यास 75 माइक्रोन, कुल लंबाई 65 सेमी, प्रभावी लंबाई 50 सेमी।

तापमान: 28.0 डिग्री सेल्सियस। नमूना इंजेक्शन समय: 1.5 s (वैक्यूम)।

पहचान: 1 - लाइसिन, 2 - आर्जिनिन, 3 - हिस्टिडीन, 4 - ग्लाइसिन, 5 - ऐलेनिन, 6 - वेलिन, 7 - आइसोल्यूसीन, 8 - ल्यूसीन, 9 - सेरीन, 10 - थ्रेओनीन, 11 - मेथियोनीन, 12 - फेनिलएलनिन, 13 - ग्लूटामिक एसिड, 14 - प्रोलाइन, 15 - एसपारटिक एसिड, 16 - टायरोसिन।

चूंकि पीएच 7 पर लागू शास्त्रीय सीजेडई आवश्यक पृथक्करण गुणवत्ता प्रदान नहीं करता था, इसलिए मुक्त एए के विश्लेषण के लिए प्रत्यक्ष यूवी पहचान के साथ एमईकेसी पद्धति को लागू करने का निर्णय लिया गया था। सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) को डिटर्जेंट के रूप में बफर समाधान में जोड़ा गया था। काम के दौरान, सहायक इलेक्ट्रोलाइट के घटकों के विभिन्न सांद्रता का उपयोग किया गया था। 133 मिमी बोरिक एसिड, 33 मिमी सोडियम बोरेट, और 100 मिमी एसडीएस, पीएच 9.5 युक्त एक सहायक इलेक्ट्रोलाइट का उपयोग करके सर्वोत्तम परिणाम प्राप्त किए गए थे। संकेतित संरचना के इलेक्ट्रोलाइट के उपयोग ने मुख्य क्षेत्र में पड़े पृष्ठभूमि इलेक्ट्रोलाइट के पीएच मानों पर एक साथ निर्धारण के साथ विश्लेषण किए गए एए की संख्या में काफी वृद्धि की है। अंजीर में। 3 14 AA के मिश्रण का इलेक्ट्रोफेरोग्राम दिखाता है।

चावल। 3. प्रत्यक्ष यूवी डिटेक्शन के साथ माइक्रेलर इलेक्ट्रोकेनेटिक क्रोमैटोग्राफी द्वारा 14 मुक्त एए के मिश्रण का पृथक्करण केशिका: आंतरिक व्यास 50 माइक्रोन, कुल लंबाई 122 सेमी, प्रभावी लंबाई 35 सेमी। बफर:

133 एमएम बोरिक एसिड, 33 एमएम सोडियम टेट्राबोरेट (पीएच 9.5) 100 एमएम सोडियम डोडेसिल सल्फेट। वोल्टेज: 20 केवी। वर्तमान ताकत: 48 μA। तापमान: 27.5 oC। नमूना इंजेक्शन समय: 3.0 s (वैक्यूम)।

एके की शुरू की गई राशि 5.0 एनजी है। ऐलेनिन, वेलिन, आइसोल्यूसीन, और ग्लाइसिन 7.0 एनजी

पहचान: 1 - वेलिन, 2 - ऐलेनिन, 3 - आइसोल्यूसीन, 4 - ग्लाइसिन, 5 - सेरीन, 6 - थ्रेओनीन, 7 - टायरोसिन, 8 - हिस्टिडीन, 9 - फेनिलएलनिन, 10 - आर्जिनिन, 11 - लाइसिन, 12 - सिस्टीन, 13 - मेथियोनीन, 14 - ग्लूटामिक अम्ल। * - सिस्टम चोटियों।

प्रवास के समय के प्राप्त मूल्य उल्लेखनीय हैं।

छोटी प्रभावी केशिका लंबाई के बावजूद, वे एक नियम के रूप में, शास्त्रीय सीजेडई के मामले में अधिक हैं, जो एमईकेसी की प्रकृति के साथ अच्छे समझौते में है। यह प्रति केशिका इकाई लंबाई में लागू वोल्टेज के परिमाण से भी संबंधित हो सकता है। एए को अलग करने के लिए आवश्यक प्रवासन समय में अंतर सीजेडई के मामले की तुलना में काफी कम है। यह 0.5 मिनट के लिए पर्याप्त है।

14 आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड एए की पृथक्करण स्थितियों का अधिक विस्तृत अध्ययन किया गया, जो आमतौर पर स्वस्थ दाताओं के रक्त प्लाज्मा में एक स्वतंत्र अवस्था में मौजूद होते हैं। पीक रेजोल्यूशन की डिग्री पर विभिन्न कार्बनिक सॉल्वैंट्स की पृष्ठभूमि इलेक्ट्रोलाइट के लिए पीएच और एडिटिव्स के प्रभाव का अध्ययन किया गया था। प्रयोग से यह निष्कर्ष निकलता है कि 14 एए मिश्रण के पूर्ण पृथक्करण को प्राप्त करने के लिए, पीएच मान 9.0-10.0 की सीमा में होना चाहिए। यदि पीएच निर्दिष्ट सीमा से बाहर है, तो AK का आवश्यक रिज़ॉल्यूशन प्रदान नहीं किया जाता है। जाहिर है, पीएच 9 पर यह पीकेए (एए) मूल्यों के बीच अंतर के कारण है, और पीएच 10 पर, एसडीएसएनए संयुग्मों के आंशिक अपघटन के कारण। कार्बनिक विलायक परिवर्धन के प्रभाव का अध्ययन मेथनॉल, 2-प्रोपेनॉल और एसीटोनिट्राइल का उपयोग करके किया गया था। प्राप्त आंकड़ों से पता चलता है कि किसी भी कार्बनिक सॉल्वैंट्स को जोड़ने से प्रवासन समय और चयनात्मकता गुणांक में महत्वपूर्ण परिवर्तन होता है। परिवर्तन की प्रकृति योजक की प्रकृति और एकाग्रता से निर्धारित होती है। मेथनॉल और एसीटोनिट्राइल अध्ययन किए गए एए के पृथक्करण में सुधार नहीं करते हैं, जो स्पष्ट रूप से मिश्रित संयुग्म AK-SDS-R बनाने की उनकी कम क्षमता के कारण है, जहां R एक कार्बनिक विलायक अणु है। 3-5% 2-प्रोपेनॉल के अलावा एए माइग्रेशन समय में अपेक्षाकृत कम वृद्धि के साथ, घटकों के संकल्प की डिग्री में काफी सुधार होता है। 2-प्रोपेनॉल की एकाग्रता में वृद्धि के साथ, एए प्रवासन समय में उल्लेखनीय वृद्धि देखी जाती है, जिससे निर्धारण की गति में कमी आती है। विशेष अध्ययनों से पता चला है कि एक कार्बनिक विलायक (2-प्रोपेनॉल) की प्रभावी मात्रा की उपस्थिति में एए का सबसे अच्छा पृथक्करण तब होता है जब पृष्ठभूमि इलेक्ट्रोलाइट में 50 मिमी बोरिक एसिड, 33 मिमी सोडियम बोरेट और 50 मिमी एसडीएस होता है। अंजीर में। 4 14 AA के मिश्रण का इलेक्ट्रोफेरोग्राम दिखाता है।

ये डेटा 14 आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड एए में से 13 के कुशल पृथक्करण का संकेत देते हैं। कुल जुदाई का समय न्यूनतम से अधिक नहीं है। प्रवासन समय का सीनियर 0.03 है। थोड़ा अधिक सीनियर मान, 0.06-0.08 के करीब, ऐलेनिन, वेलिन और हिस्टिडीन के लिए मनाया जाता है।

चावल। 4. एमईकेसी विधि द्वारा 14 एए मिश्रण को प्रत्यक्ष यूवी डिटेक्शन केशिका के साथ अलग करना: आंतरिक व्यास 75 माइक्रोन, कुल लंबाई 61 सेमी, प्रभावी लंबाई 41 सेमी।

बफर: 33 एमएम सोडियम टेट्राबोरेट, 100 एमएम बोरिक एसिड, 50 एमएम एसडीएस, 5% 2-प्रोपेनॉल, पीएच = 10.2। वोल्टेज: 25 केवी। वर्तमान ताकत: 65 μA। तापमान: 29.5 डिग्री सेल्सियस। नमूना इंजेक्शन समय: 1.5 s (वैक्यूम)। एके की शुरू की गई राशि 0.5 एनजी है।

पहचान: 1-लाइसिन; 2 - प्रोलाइन; 3 - फेनिलएलनिन; 4 - अलैनिन; 5 - वेलिन; 6 - ग्लाइसिन;

7 - हिस्टिडीन; 8 - टायरोसिन; 9 - ल्यूसीन + आइसोल्यूसीन; 10 - सेरीन; 11 - थ्रेओनाइन; 12 - ग्लूटामिक एसिड; 13 - सिस्टीन।

संकल्प के प्राप्त स्तर ने माना एसी के मात्रात्मक निर्धारण पर अध्ययन करना संभव बना दिया। ज्ञात संरचना के 14 एए के मॉडल मिश्रण का विश्लेषण किया गया था। अध्ययनों से पता चला है कि 3-5% 2-प्रोपेनॉल युक्त बोरेट बफर समाधान का उपयोग करके प्रत्यक्ष यूवी पहचान के साथ एमईकेसी विधि 14-16 आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड एए के मात्रात्मक निर्धारण की अनुमति देती है जिसमें 30 मिनट से कम समय में 6-8% की त्रुटि (सीनियर) होती है। . प्राप्त परिणामों की सटीकता को अतिरिक्त रूप से "जोड़ा-पाया" विधि (तालिका 1) द्वारा किया गया था। MEKH विधि (मो (एए) = 0.50 एनजी द्वारा आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड एए की सामग्री के निर्धारण की शुद्धता का सत्यापन; पेश किया गया - 1.00 एनजी) होमोसिस्टीन और अन्य कम आणविक भार प्लाज्मा एमिनोथिओल्स का विश्लेषण रक्त प्लाज्मा होमोसिस्टीन (एचएसयू) और साथ में एमिनोथिओल्स (एटी) (एन्कोडेड एमिनो एसिड - सिस्टीन (सीआईएस), ग्लूटाथियोन ट्रिपेप्टाइड (जीएसएच)) रक्त प्लाज्मा कार्डियोवैस्कुलर डिसफंक्शन के आणविक मार्कर हैं। इस अध्ययन का मुख्य लक्ष्य होमोसिस्टीन की सामग्री को ऐसी बीमारियों के लिए एक विश्वसनीय जोखिम कारक के रूप में निर्धारित करने के लिए एक विधि विकसित करना था।

कम-आणविक-वजन वाले रक्त प्लाज्मा एमिनोथिओल्स के मात्रात्मक विश्लेषण में डाइसल्फ़ाइड बांडों की बहाली, रक्त प्लाज्मा का डीप्रोटीनीकरण, उपयुक्त अभिकर्मकों के साथ एमिनोथिओल्स का संशोधन, आरपी एचपीएलसी या सीई द्वारा एक या किसी अन्य पहचान विधि के साथ संशोधित एमिनोथिओल्स की पहचान और पहचान शामिल है। इस काम में ट्राइफेनिलफॉस्फीन से ऑक्सीकृत और प्रोटीन युक्त अमीनोथिओल्स को कम किया गया। भारी धातु के पिंजरों को हटाने के लिए, एक EDTA योज्य का उपयोग किया गया था। प्रस्तावित कमी तकनीक ने कमरे के तापमान पर तेजी से (15 मिनट) और डाइसल्फ़ाइड की पूर्ण कमी (96%) और सल्फ़हाइड्रील समूहों को मुक्त किया। कमी प्रतिक्रियाओं की पैदावार मुक्त एंटीबॉडी की सामग्री को मापने के लिए एक मानक तकनीक का उपयोग करके निर्धारित की गई थी। उच्च आणविक भार प्लाज्मा प्रोटीन 5-सल्फोसैलिसिलिक एसिड के साथ अवक्षेपित थे।

अध्ययन के दौरान इसकी एकाग्रता को अनुकूलित किया गया था, जिससे न्यूट्रलाइजेशन चरण में कमजोर पड़ने के कारण संवेदनशीलता के नुकसान से बचना संभव हो गया।

मुक्त सल्फहाइड्रील को मोनोब्रोमोबिमैन (mBrB) या 5-आयोडोएसिटामिडो-फ्लोरेसिन (5-IAF) के साथ संशोधित किया गया था। आवश्यक पीएच मान डायथेनॉलमाइन (पीके ए = 8.9) और सोडियम ऑर्थोफॉस्फेट के साथ बनाए रखा गया था, जो एटी संशोधन के लिए उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मक पर निर्भर करता है। डायथेनॉलमाइन के उपयोग ने मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा लक्ष्य उत्पादों के गठन की प्रत्यक्ष निगरानी करना संभव बना दिया। एटी डेरिवेटिव्स की पहचान करने के लिए, फोटोमेट्रिक और फ्लोरोमेट्रिक डिटेक्शन विधियों का इस्तेमाल किया गया था। डेरिवेटिव को अवशोषण, फ्लोरीमेट्रिक और मास (MALDI-TOF, ESI) स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा विशेषता दी गई थी। अवशोषण स्पेक्ट्रा (एचएसयू-एमबी - 234 एनएम) और हसी डेरिवेटिव्स (390 एनएम (उत्तेजना) और 478 एनएम (प्रतिदीप्ति)) के प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा से चयनित तरंग दैर्ध्य पर फोटोमेट्रिक और फ्लोरीमेट्रिक का पता लगाया गया था। हसी-एएफ संयुग्म के प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम से, यह इस प्रकार है कि फ्लोरोमेट्रिक पहचान के साथ, उत्तेजना के लिए इष्टतम तरंग दैर्ध्य 462 एनएम है, और प्रतिदीप्ति के लिए, 504 एनएम है।

मोनोबिमेन और फ्लोरेसिन डेरिवेटिव दोनों की पहचान के लिए एक ही डिटेक्टर का उपयोग करने की मौलिक संभावना को निर्धारित करने और परीक्षण करने के तरीकों को एकजुट करने के लिए, 390 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर उत्तेजना दक्षता का अध्ययन किया गया था। प्राप्त अधिकतम प्रतिदीप्ति की तीव्रता, और, परिणामस्वरूप, निर्धारण की संवेदनशीलता 462 एनएम के तरंग दैर्ध्य पर विकिरण के उत्तेजना के लिए उपयोग किए जाने की तुलना में कम परिमाण का एक क्रम था।

एटी के व्यक्तिगत मोनोब्रोम्बिमेन (एमबी) और एसिटामिडोफ्लोरेसिन (एएफ) डेरिवेटिव, साथ ही साथ उनके मॉडल मिश्रण का विश्लेषण किया गया। व्यक्तिगत मोनोब्रोम्बिमेन डेरिवेटिव्स सीआईएस, एचएसयू, और जीएसएच क्रमशः 6.01 ± 0.19, 10.76 ± 0.17, और 11.89 ± 0.11 के अवधारण समय (न्यूनतम) के साथ संवर्धित (चित्र 5) 1.

ज्ञात संरचना के अमीनोथिओल्स के मिश्रण का उपयोग करते समय समान अवधारण समय बनाए रखा जाता है। प्राप्त प्रयोगात्मक डेटा ने संशोधन प्रतिक्रिया की उपज की गणना करना संभव बना दिया। यह 97% से कम नहीं था, जो ज्ञात आंकड़ों के साथ अच्छा समझौता है, लेकिन नमूना तैयार करने की अधिक गंभीर परिस्थितियों में प्राप्त किया गया था। परिणामी डेरिवेटिव को मिश्रण से अलग किया गया और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विशेषता दी गई।

fluorescein डेरिवेटिव Cys, Hcu और GSH प्रतिधारण समय (मिनट) 8.49 ± 0.12 के साथ eluted; 10.46 ± 0.15 और 12.96 ± 0.14, क्रमशः (चित्र 6)।

क्रोमैटोग्राफिक विश्लेषण घरेलू उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफ "मिलिख्रोम ए -02" (एकोनोवा, नोवोसिबिर्स्क) पर किया गया था। 5. मोनोब्रोमोबिमेन के साथ संशोधित एमिनोथिओल्स के एक मॉडल मिश्रण का आरपी एचपीएलसी। Cys-MB-50.0 μM, Hcy-MB-25.0 μM, GS-MB-25.0 μM।

फ्लोरीमेट्रिक डिटेक्शन (exc = 390 nm, exc = 478 nm) अंजीर। 6. आरपी एचपीएलसी 5-आयोडोएसिटामिडोफ्लोरेसिन के साथ संशोधित एमिनोथिओल्स के एक मॉडल मिश्रण का। Cys-AF-100.0 μM, Hcy-AF-150.0 μM, GS-AF μM। फ्लोरीमेट्रिक डिटेक्शन (अवशोषण = 390 एनएम, p = 478 एनएम) जब 5-आईएएफ को एक लेबल के रूप में उपयोग किया जाता है, तो थिओल-मोनोबिमेन संयुग्मों की तुलना में थियोल-फ्लोरोसेंट संयुग्मों के लिए बेहतर शिखर संकल्प प्राप्त किया जाता है। एटी 5-आईएएफ संशोधन प्रतिक्रिया की उपज, फ्लोरोसेंट लेबल के शिखर की तीव्रता में कमी के द्वारा प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित, 95% थी। प्राप्त सभी डेरिवेटिव को मिश्रण से अलग किया गया और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विशेषता दी गई।

प्राप्त डेटा होमोसिस्टीन के मात्रात्मक निर्धारण के लिए एक विधि के विकास के आधार के रूप में कार्य करता है। अंशांकन वक्र के निर्माण के लिए, मिश्रण के नमूनों का उपयोग 2.5 से 100 μM तक की सामग्री के साथ किया गया था। चयनित अंतराल में एचसीयू (5-50 माइक्रोन) की शारीरिक सांद्रता की सीमा शामिल है। एमबीआरबी को एक लेबल के रूप में इस्तेमाल किया गया था। मिश्रण में होमोसिस्टीन की सामग्री पर क्रोमैटोग्राफिक शिखर के क्षेत्र की प्राप्त अंशांकन निर्भरता संपूर्ण अध्ययन एकाग्रता सीमा में रैखिक है और इसे समीकरण द्वारा वर्णित किया गया है:

शिखर क्षेत्र द्वारा निर्धारण के परिणामों का सापेक्ष मानक विचलन 0.083 से अधिक नहीं है, और बाहर निकलने के समय से - 0.026। एमवी डेरिवेटिव की फ्लोरोमेट्रिक पहचान के लिए पता लगाने की सीमा 1 माइक्रोन (छवि 7) है।

चावल। 7. एचएसयू एकाग्रता पर क्रोमैटोग्राफिक शिखर के क्षेत्र में परिवर्तन विधि की प्रभावशीलता की पुष्टि व्यक्तिगत पदार्थों के लिए प्राप्त क्रोमैटोग्राम और प्रस्तावित विधि के अनुसार तैयार किए गए रक्त प्लाज्मा के नमूनों की तुलना करके की जाती है। किए गए अध्ययनों ने रक्त प्लाज्मा में होमोसिस्टीन, सिस्टीन और ग्लूटाथियोन के मात्रात्मक निर्धारण के लिए एक विधि विकसित करना और उनके एमवी डेरिवेटिव (छवि 8) के रूप में उपर्युक्त एंटीबॉडी के नियमित विश्लेषण के लिए सफलतापूर्वक इसका उपयोग करना संभव बना दिया। . विधि विकसित करते समय, "पेश-पाया" विधि (तालिका 2) द्वारा अतिरिक्त नियंत्रण किया गया था।

चावल। 8. स्वस्थ दाता से रक्त प्लाज्मा का आरपी एचपीएलसी। Cys-MB-192.4 μM, HcyMB-10.1 μM, GS-MB-15.7 μM। फ्लोरीमेट्रिक डिटेक्शन माइक्रोकॉलम एचपीएलसी विधि द्वारा एमवी डेरिवेटिव के रूप में एचसीयू का निर्धारण। विकसित विधि का उपयोग करते हुए, स्वस्थ रोगियों और अलग-अलग गंभीरता के हृदय रोगों से पीड़ित रोगियों के 50 से अधिक रक्त प्लाज्मा नमूनों का विश्लेषण किया गया। स्वस्थ रोगियों के लिए, सुबह खाली पेट एक नस से प्राप्त रक्त प्लाज्मा में एटी का औसत मूल्य (μM) था:

एचएसयू 12.75 ± 3.21 के लिए, जीएसएच 9.53 ± 1.17 के लिए और सीआईएस 206.34 ± 24.61 के लिए। प्राप्त एकाग्रता मूल्य साहित्य में दिए गए संदर्भ मूल्यों की सीमा के भीतर आते हैं। हृदय रोगों से पीड़ित रोगियों के लिए, रक्त प्लाज्मा में हसी की सांद्रता रोग की गंभीरता पर निर्भर करती है। परिणाम रोगियों की नैदानिक ​​​​स्थिति से संबंधित हैं।

फोटोमेट्रिक जैसी सस्ती और व्यापक पहचान पद्धति के उपयोग से एटी विश्लेषण की संभावना की जांच की गई है। प्रयोग से पता चला कि यह एक संवेदनशीलता प्रदान करता है जो रक्त प्लाज्मा में एटी की पैथोलॉजिकल रूप से उच्च सामग्री को निर्धारित करना संभव बनाता है। फोटोमेट्रिक डिटेक्शन का उपयोग करते समय, लेबल के रूप में 5-IAF का उपयोग करना बेहतर होता है, क्योंकि इस मामले में चोटियों को बेसलाइन (छवि 9) के लिए हल किया जाता है, जो मात्रात्मक निर्धारण की अनुमति देता है।

चावल। 9. मोनोब्रोमोबिमैन (ए) और 5-आयोडोएसिटामिडोफ्लोरेसिन (बी) के साथ संशोधित एमिनोथिओल्स के मॉडल मिश्रण का आरपी एचपीएलसी। ए) Cys-MB-50.0 μM, HcyMB-25.0 μM, GS-MB-25.0 μM। बी) Cys-AF-50.0 μM, Hcy-AF-75.0 μM, GS-AF-25.0 μM। फोटोमेट्रिक डिटेक्शन (ए = 234 एनएम, बी = 250 और 300 एनएम) इस प्रकार, प्रदर्शन किए गए कार्य ने नमूना तैयार करने के चरण को अनुकूलित करना संभव बना दिया, इसे "हल्के परिस्थितियों" के तहत विश्लेषण किए गए घटक की गारंटीकृत मात्रात्मक उपज के साथ किया जा सकता है। इसके आधार पर, एक ऐसी तकनीक विकसित की गई है जो स्वस्थ और बीमार रोगियों के रक्त प्लाज्मा में कम आणविक भार एंटीबॉडी की सामग्री को जल्दी और मज़बूती से निर्धारित करना संभव बनाती है। माप त्रुटि 8.5% से अधिक नहीं है। मापा सांद्रता (2.5 माइक्रोन) की सीमा की निचली सीमा रक्त प्लाज्मा में एचसीयू की कम सामग्री को निर्धारित करने के लिए इस तकनीक का उपयोग करने की मौलिक संभावना की गवाही देती है। वर्णित विधि का पता लगाने की सीमा 1 माइक्रोन है। विकसित तकनीक का रोगियों के वास्तविक रक्त प्लाज्मा नमूनों पर परीक्षण किया गया है और इसे नियमित उपयोग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

होमोसिस्टीन और अन्य कम आणविक भार प्लाज्मा एमिनोथिओल्स अंजीर का निर्धारण। 10. एटी मॉडल मिश्रण के सीजेडई में 6.18 ± 0.16 का माइग्रेशन समय है; सिस्टीन को क्रमशः mBrB Hcy-MB-700.0 µM, Cys-MB-300.0 µM 6.83 ± 0.20 और ग्लूटाथियोन - 8.54 ± 0.17 मिनट के साथ संशोधित किया गया (चित्र 10)। जीएस-एमबी की तुलना में - 700.0 माइक्रोन। (अवशोषण = 234 एनएम)।

केशिका: आंतरिक व्यास 50 माइक्रोन, आधा एचपीएलसी, लागू सीजेडई विधि 82 सेमी की लंबाई, 62 सेमी की प्रभावी लंबाई की अनुमति देती है।

बफर: 50 मिमी सोडियम टेट्राबोरेट पीएच = 11.0। एटी विश्लेषण के समय को 2-3 मिनट तक कम करें।

वोल्टेज: 25 केवी। वर्तमान ताकत: 58 μA।

(वैक्यूम) प्रत्यक्ष यूवी पहचान रक्त प्लाज्मा में एचसीयू की थोड़ी मात्रा का पता लगाने के लिए अपर्याप्त है। 10 माइक्रोन की होमोसिस्टीन सामग्री पर, संकेत / पृष्ठभूमि अनुपात 2.5-3 है, और सापेक्ष मानक विचलन 0.3-0.5 की सीमा में है। यह विधि पैथोलॉजिकल रूप से उच्च एचसीयू सामग्री (25 माइक्रोन) वाले रोगियों के रक्त प्लाज्मा में एचसीयू सामग्री की निगरानी के लिए लागू होती है। ऐसी सांद्रता के लिए सापेक्ष मानक विचलन MB-Cys के लिए 0.12, MB-Hcy के लिए 0.18 और MB-GS के लिए 0.17 है।

फ्लोरीमेट्रिक डिटेक्शन के साथ केशिका क्षेत्र वैद्युतकणसंचलन नैनोफोर 02 केशिका आयन विश्लेषक (आईएएनपी आरएएस, सेंट पीटर्सबर्ग) पर किया गया था। एएफ डेरिवेटिव के मॉडल मिश्रण की जांच सीजेडई विधि द्वारा प्रत्यक्ष फोटोमेट्रिक (छवि 11) और फ्लोरीमेट्रिक (छवि 12) के साथ की गई थी। ) पता लगाना (तालिका 3)। फोटोमेट्रिक डिटेक्शन 492 एनएम के तरंग दैर्ध्य पर किया गया था, जो 5-आईएएफ के उत्तेजना तरंग दैर्ध्य से मेल खाती है। फ्लोरोमेट्रिक डिटेक्शन के साथ, उत्तेजना तरंग दैर्ध्य 473 एनएम था, और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य 514 एनएम था। यह पाया गया कि 5-IAP के उपयोग से फ्लोरोमेट्रिक डिटेक्शन के साथ CZE विधि द्वारा HcU निर्धारण की संवेदनशीलता को बढ़ाना संभव हो जाता है।

अवशोषण, 492 एनएम अंजीर। 11. मॉडल मिश्रण का KZE एटी, मो- अंजीर। 12. ATs के एक मॉडल मिश्रण का CZE, 5-आयोडोएसेटामिडो-संशोधित 5-आयोडोएसिटामिडोफ्लोरेसिन के साथ संशोधित फ़्लोरोमेट्रिक Hcy-AF-100.0 μM, Cys-AF-300.0 μM, GS-AF-Hcy-AF-15 के साथ प्रत्यक्ष यूवी फ़्लोरेसिन के साथ, 0 μM, Cys-AF-15.0 μM, GS-AF μM। (अवशोषण = 473 एनएम, क्स्प = 514 एनएम) 700.0 माइक्रोन। (अवशोषण = 492 एनएम)।

केशिका: भीतरी व्यास 50 माइक्रोन, पूर्ण केशिका: भीतरी व्यास 50 माइक्रोन, कुल लंबाई 68 सेमी, प्रभावी लंबाई 53 सेमी। लंबाई 65 सेमी, प्रभावी लंबाई 57 सेमी।

बफर: 25 मिमी सोडियम टेट्राबोरेट, 25 मिमी फॉस्फेट बफर: 25 मिमी सोडियम टेट्राबोरेट, 25 मिमी सोडियम फॉस्फेट पीएच = 11.2। वोल्टेज: 20 केवी। वर्तमान ताकत: सोडियम पीएच = 11.2। वोल्टेज: 20 केवी। वर्तमान ताकत:

22 μA। तापमान: 25.0 डिग्री सेल्सियस। इंजेक्शन का समय 18 µ ए है । तापमान: 25.0 डिग्री सेल्सियस। नमूना इंजेक्शन समय: 5 एस (इलेक्ट्रोकाइनेटिक रूप से, वोल्टेज पर: 5 एस (इलेक्ट्रोकाइनेटिक रूप से, वोल्टेज पर)

केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन की विधि द्वारा शारीरिक तरल पदार्थों में आणविक मार्करों की सामग्री में परिवर्तन रोगी की आनुवंशिक प्रवृत्ति के कारण किसी विशेष बीमारी के कारण भी हो सकता है। इसलिए, अध्ययन के तहत बीमारी के कारण और अधिक प्रभावी चिकित्सा के निर्धारण की विश्वसनीयता बढ़ाने के लिए डीएनए अंशों का तुलनात्मक विश्लेषण करना आवश्यक है।

इस काम में, हमने एलील-विशिष्ट पीसीआर का उपयोग करके शिरापरक घनास्त्रता के उत्परिवर्ती जीन के टुकड़ों के उदाहरण का उपयोग करके डीएनए अणुओं में उत्परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए उपलब्ध घरेलू सीई उपकरण का उपयोग करने की संभावना की जांच की। न्यूक्लियोटाइड्स का पृथक्करण केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन (सीजीई) द्वारा 25 से 100 माइक्रोन के व्यास के साथ अनमॉडिफाइड सिलिका ग्लास केशिकाओं का उपयोग करके किया गया था। घरेलू उत्पादन के रैखिक पॉली-एन, एन-डाइमिथाइलएक्रिलामाइड (पीडीएमए) को एक अलग मैट्रिक्स के रूप में इस्तेमाल किया गया था। इस बहुलक की पसंद CHE के चिप संस्करण में इसके उपयोग की संभावना से जुड़ी है। पीडीएमए को सीजेएससी सिंटोल में रेडिकल पोलीमराइजेशन द्वारा डाइमिथाइलैक्रिलामाइड मोनोमर से संश्लेषित किया गया था। श्रृंखला की लंबाई को तापमान में परिवर्तन करके या कट्टरपंथी जाल जोड़कर नियंत्रित किया गया था। 5-8% पीडीएमए मोनोमर युक्त पॉलिमर का इस्तेमाल किया। 0.1 M TBE (0.1 M TRIS, 0.1 M बोरिक एसिड, और 2.5 mM EDTA; pH = 8.3) और 0.1 M TAPS (N-tris (हाइड्रॉक्सीमिथाइल) मिथाइल 3-एमिनोप्रोपेनसल्फ़ोनिक एसिड; pH = 8.3) सभी परीक्षण किए गए पॉलिमर का स्तर निम्न था देशी प्रतिदीप्ति (0.5 AU) की। 0.1M TAPS का उपयोग करके तैयार किए गए पॉलिमर जेल के साथ केशिका को फिर से भरने के बिना 5 अलगाव तक की अनुमति देते हैं, जबकि TBE वाले 3 से अधिक की अनुमति नहीं देते हैं। ये पॉलिमर संबंधित पश्चिमी समकक्षों के लिए तुलनीय एक संकल्प प्रदान करते हैं, लेकिन साथ ही साथ अधिक किफायती होते हैं। .

5-15 एन की लंबाई के साथ फ्लोरोसेंटली लेबल वाले पॉलीन्यूक्लियोटाइड्स के मिश्रण का अध्ययन। तदनुसार, उनमें से प्रत्येक के 10-9 एम की सामग्री के साथ, 100 एनटी तक की श्रृंखला लंबाई के साथ ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को अलग करने के लिए बहुलक की इष्टतम संरचना निर्धारित करना संभव था। (अंजीर। 13)। यह एक pDMA-आधारित जेल है जिसमें 6% मोनोमर, 7M यूरिया और 0.1M TAPS है।

चावल। 13. लंबाई के साथ पॉलीन्यूक्लियोटाइड के मिश्रण का पृथक्करण केशिका: आंतरिक व्यास - 50 माइक्रोन, कुल लंबाई - 45 सेमी, प्रभावी लंबाई - 38.5 सेमी। पॉलिमर: 6% पीडीएमए मोनोमर, 0.1 एम टीएपीएस, 7 एम यूरिया। काम कर रहे इलेक्ट्रोलाइट: 0.1M TAPS। वोल्टेज:

10 केवी। वर्तमान ताकत: 4.3 μA। तापमान: 25.0 डिग्री सेल्सियस। नमूना इंजेक्शन समय 10 एस (इलेक्ट्रोकाइनेटिक रूप से, नमूना संग्रह के दौरान वोल्टेज - 10 केवी)।

अलगाव की स्थिति (वोल्टेज, वर्तमान, प्रभावी लंबाई और केशिका के व्यास) के अनुकूलन ने 100 एनटी से कम की कुल लंबाई के साथ ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स की आधार रेखा को अलगाव प्राप्त करना संभव बना दिया। और 1 एन डी की लंबाई में अंतर। (अंजीर। 14.)।

चावल। 14. 1 एनटी की लंबाई के अंतर के साथ पोलीन्यूक्लियोटाइड्स के मिश्रण का पृथक्करण।

केशिका: भीतरी व्यास 50 µm, कुल लंबाई 65 सेमी, प्रभावी लंबाई 57.5 सेमी. पॉलिमर: 6% pDMA मोनोमर, 0.1M TAPS, 7M यूरिया। काम कर रहे इलेक्ट्रोलाइट: 0.1M TAPS। वोल्टेज:

11 केवी. वर्तमान ताकत: 5.1 μA। तापमान: 25.0 डिग्री सेल्सियस। नमूना इंजेक्शन समय 10 एस (इलेक्ट्रोकाइनेटिक रूप से, नमूना संग्रह के दौरान वोल्टेज - 10 केवी)।

प्राप्त डेटा शिरापरक घनास्त्रता (मानव रक्त जमावट प्रणाली के कारक वी जीन के लीडेन) के उत्परिवर्ती जीन के तेजी से और प्रभावी निदान के लिए एक प्रणाली के विकास के आधार के रूप में कार्य करता है।

जंगली और उत्परिवर्ती प्रकार (अंतर 5 एनटी) के उत्पादों के संयुक्त निर्धारण की संभावना को साबित करने के लिए, निम्नलिखित पीसीआर किया गया था: 1.

जंगली प्रकार के डीएनए (कोई उत्परिवर्तन नहीं) + जंगली प्रकार के प्राइमर; 2. जंगली प्रकार के डीएनए (कोई उत्परिवर्तन नहीं) + एफवी लीडेन प्राइमर; 3. डीएनए एक विषमयुग्मजी एफवी लीडेन उत्परिवर्तन + एफवी लीडेन प्राइमर के साथ; 4. डीएनए के बिना एफवी लीडेन प्राइमर। प्रतिक्रिया उत्पादों, फॉर्मामाइड के साथ उपचार और पानी के साथ कमजोर पड़ने के बाद, सीएचई विधि द्वारा फ्लोरोमेट्रिक पहचान के साथ विश्लेषण किया गया था। नमूने 1 और 3 के विश्लेषण ने पीसीआर के बाद मिश्रण में एक उत्पाद की उपस्थिति दिखाई, और नमूने 2 और 4 - इसकी अनुपस्थिति। इस पैटर्न की पुष्टि करने के लिए, उत्परिवर्ती प्राइमर / उत्परिवर्ती उत्पाद और जंगली-प्रकार के प्राइमर / जंगली-प्रकार के उत्पाद के मिश्रण का विश्लेषण 1: 1 अनुपात (चित्र 15) में किया गया था।

चावल। 15. उत्परिवर्ती और गैर-उत्परिवर्ती पीसीआर उत्पाद का संयुक्त निर्धारण केशिका: आंतरिक व्यास - 50 माइक्रोन, कुल लंबाई - 45 सेमी, प्रभावी लंबाई - 38.5 सेमी। पॉलिमर 6% पीडीएमए मोनोमर, 0.1 एम टीएपीएस, 7 एम यूरिया। काम कर रहे इलेक्ट्रोलाइट: 0.1M TAPS। वोल्टेज: 12 केवी।

वर्तमान ताकत: 6.5 μA। तापमान: 25.0 डिग्री सेल्सियस। नमूना लेने का समय: 10 एस (इलेक्ट्रोकाइनेटिक रूप से, नमूनाकरण के दौरान वोल्टेज - 10 केवी)।

प्राप्त डेटा एलील-विशिष्ट पीसीआर उत्परिवर्तन एफवी लीडेन और जंगली प्रकार के उत्पादों के संयुक्त निर्धारण की संभावना को दर्शाता है। प्रस्तावित दृष्टिकोण, अर्थात् विभिन्न लंबाई के एलील-विशिष्ट प्राइमरों का चयन और संश्लेषण और एक सामान्य काउंटर प्राइमर, जिसके बाद फ्लोरोमेट्रिक डिटेक्शन के साथ सीजीई विधि द्वारा विश्लेषण किया जाता है, का उपयोग अन्य आनुवंशिक रूप से निर्धारित बीमारियों के निदान के लिए किया जा सकता है। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का विश्लेषण अमीनो एसिड और शॉर्ट पेप्टाइड्स के विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले मानक रूसी उपकरणों का उपयोग करके किया जा सकता है।

1. रीफ्रैक्टोमेट्रिक और डायरेक्ट यूवी डिटेक्शन के साथ माइक्रेलर इलेक्ट्रोकेनेटिक क्रोमैटोग्राफी और केशिका जोनल वैद्युतकणसंचलन द्वारा उनके प्रारंभिक व्युत्पन्नकरण के बिना आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड अमीनो एसिड के विश्लेषण के लिए तरीके विकसित किए गए हैं। पृथक्करण दक्षता पर पृष्ठभूमि इलेक्ट्रोलाइट की संरचना और पीएच के साथ-साथ कार्बनिक सॉल्वैंट्स के प्रभाव का अध्ययन किया गया है।

2. प्रत्यक्ष यूवी डिटेक्शन के साथ माइक्रेलर इलेक्ट्रोकेनेटिक क्रोमैटोग्राफी की विधि 14 आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड मुक्त अमीनो एसिड के मॉडल मिश्रण के मात्रात्मक निर्धारण के लिए की गई थी।

3. फ्लोरोमेट्रिक डिटेक्शन के साथ रिवर्स-फेज एचपीएलसी की विधि द्वारा स्वस्थ और बीमार रोगियों के रक्त प्लाज्मा में कम आणविक-वजन वाले एमिनोथिओल्स की सामग्री के तेजी से और विश्वसनीय निर्धारण के लिए एक विधि विकसित की गई है। रक्त प्लाज्मा में होमोसिस्टीन की कम सामग्री को निर्धारित करने के लिए इस तकनीक का उपयोग करने की मौलिक संभावना दिखाई गई है। विकसित तकनीक का परीक्षण मरीजों के रक्त प्लाज्मा के वास्तविक नमूनों पर किया गया है।

4. फोटोमेट्रिक डिटेक्शन के साथ केशिका क्षेत्र वैद्युतकणसंचलन की विधि द्वारा रक्त प्लाज्मा में होमोसिस्टीन की उच्च सांद्रता को निर्धारित करने की संभावना दिखाई गई है। विकसित तकनीक का परीक्षण मरीजों के रक्त प्लाज्मा के वास्तविक नमूनों पर किया गया है। एक अवशोषित और फ्लोरोजेनिक लेबल के रूप में 5-आयोडोएसिटामिडोफ्लोरेसिन का उपयोग करने की संभावना का अध्ययन किया गया है।

5. फ्लोरोमेट्रिक डिटेक्शन के साथ केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा शिरापरक घनास्त्रता (उत्परिवर्तन एफवी लीडेन) के उत्परिवर्ती जीन के टुकड़ों के चयनात्मक निर्धारण के लिए एक विधि विकसित की गई थी। 100 एनटी तक की श्रृंखला लंबाई वाले न्यूक्लियोटाइड का विश्लेषण करने की संभावना दिखाई गई। और 1 एन डी की लंबाई में अंतर के साथ।

शोध प्रबंध की मुख्य सामग्री निम्नलिखित कार्यों में प्रस्तुत की गई है:

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मैट्रिक्स (सतह) के साथ क्रास्नोवा तात्याना अलेक्जेंड्रोवना मास स्पेक्ट्रोमेट्री पॉलीसल्फ़ोनिक, पॉलीकारबॉक्सिलिक एसिड और एंटीबायोटिक दवाओं के ओलिगोमर्स की पहचान और निर्धारण में सक्रिय लेजर desorption / आयनीकरण 02.00.02 - विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान रसायन विज्ञान के उम्मीदवार की डिग्री के लिए शोध प्रबंध का सार सेराटोव - 2013 व्लादिमीर स्टेट यूनिवर्सिटी के रसायन विज्ञान का नाम अलेक्जेंडर ग्रिगोरिविच और निकोलाई ग्रिगोरिएविच के नाम पर रखा गया ... "

"विश्लेषण विशेषता 02.00.02 - विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान टॉम्स्क - 2012 www.sp-department.ru के रासायनिक विज्ञान के उम्मीदवार की डिग्री के लिए निबंध का सार काम उच्च व्यावसायिक शिक्षा राष्ट्रीय अनुसंधान के संघीय राज्य बजटीय शैक्षिक संस्थान में किया गया था .. ।"

«SMIRNOV Aleksey Aleksandrovich PHYSICO-रासायनिक प्रक्रियाओं में गैर-बराबर कम तापमान प्लाज्मा HBr और आर्गन, हीलियम और हाइड्रोजन के साथ इसका मिश्रण 02.00.04 - भौतिक रसायन विज्ञान निबंध के वैज्ञानिक डिग्री के भौतिक विज्ञान का सार ... वैज्ञानिक सलाहकार: रासायनिक विज्ञान के डॉक्टर, प्रोफेसर एफ्रेमोव अलेक्जेंडर मिखाइलोविच आधिकारिक विरोधियों: ... "

"वासुटिन ओलेग अलेक्सेविच ने फेरोस्पिनेल के सोखने के गुणों पर संश्लेषण की स्थिति के प्रभाव का शोध और YTTRIUM FEROGRANATE की सतह के गुणों को संकाय राज्य की क्षमता के तरीकों के अनुसार। विज्ञान केंद्र की क्षमता।

«मेलनिकोवा तात्याना इगोरेवना बिस्मथ और सिलेनाइट्स स्पेशलिटी के बोरेट्स की संरचना और संरचनात्मक विशेषताओं को निर्धारित करने के लिए सैद्धांतिक और प्रायोगिक आधार का विकास 02.00.21 रसायन विज्ञान विभाग में ठोस राज्य रसायन विज्ञान विभाग रसायन विज्ञान विभाग रसायन विज्ञान का सार 2011 में रासायनिक प्रौद्योगिकियों का नाम एम.वी. लोमोनोसोव वैज्ञानिक सलाहकार: डॉक्टर ... "

«स्टारोस्टिना इरिना अलेक्सेवना एसिड-बेसिक इंटरैक्शन ऑफ पॉलिमर्स एंड मेटल्स इन एडहेशन कम्पाउंड्स 02.00.06 - उच्च आणविक यौगिक डॉक्टर ऑफ केमिकल साइंसेज कज़ान की डिग्री के लिए निबंध का सार - 2011 1 वैज्ञानिक सलाहकार तकनीकी विज्ञान के डॉक्टर, प्रोफेसर स्टोयानोव ओलेग व्लादिस्लावोविच आधिकारिक विरोधी डॉक्टर ... "

«VASILIEV व्लादिमीर पेट्रोविच स्पेक्ट्रल - इंटरमॉलिक्युलर इंटरैक्शन का ल्यूमिनसेंट अध्ययन METALOCENE COMPLEXES Zr और Hf सॉल्यूशंस 02.00.04 में करते हैं। - भौतिक रसायन विज्ञान रसायन विज्ञान के उम्मीदवार की डिग्री के लिए एक शोध प्रबंध का सार चेर्नोगोलोव्का - 2008 यह काम रूसी विज्ञान अकादमी के रासायनिक भौतिकी की समस्याओं के संस्थान और दक्षिणी संघीय विश्वविद्यालय के वैज्ञानिक पर्यवेक्षक के शैक्षणिक संस्थान में किया गया था: के उम्मीदवार रासायनिक विज्ञान LUKOVA गैलिना विक्टोरोवना आधिकारिक ... "

"SHPANCHENKO ओल्गा वलेरेवना ट्रांसपोर्ट-मैट्रिक्स आरएनए की कार्यात्मक स्थलाकृति 02.00.10 - बायोऑर्गेनिक केमिस्ट्री डॉक्टर ऑफ केमिकल साइंसेज मॉस्को की डिग्री के लिए निबंध का सार - 2010 2 काम रासायनिक संकाय के प्राकृतिक यौगिकों के रसायन विज्ञान विभाग में किया गया था। मास्को राज्य ..."

"कोशेलेवा एकातेरिना वैलेंटाइनोव्ना सॉलिड इलेक्ट्रोलाइट्स इन द सिस्टम्स CaY2S4-Yb2S3 और CaYb2S4-Y2S3 स्पेशलिटी: 02.00.05 - इलेक्ट्रोकैमिस्ट्री एब्सट्रैक्ट ऑफ केमिकल साइंसेज के उम्मीदवार की डिग्री के लिए निबंध एकाटेरिनबर्ग - 2014 2 अकार्बनिक विभाग में रसायन विज्ञान का काम किया गया था। और भौतिक विश्वविद्यालय किरोव कलिनिना ल्यूडमिला अलेक्सेवना, वैज्ञानिक सलाहकार: रासायनिक विज्ञान के उम्मीदवार, व्याटका स्टेट यूनिवर्सिटी के एसोसिएट प्रोफेसर, ... "

"Lavrentieva Ekaterina Konstantinovna बहुलक-समग्र सॉर्बेंट्स और प्लैटिनम इलेक्ट्रोकैटालिस्ट्स के गुणों को नियंत्रित करने की एक विधि के रूप में क्ले युक्त सिस्टम में टेम्प्लेटिंग विशेषता: 02.00.06 - उच्च-आणविक यौगिक 02.00.05 - इलेक्ट्रोकैमिस्ट्री भौतिक के उम्मीदवार की डिग्री के लिए निबंध का सार और गणितीय विज्ञान मास्को - 2009 भौतिकी विभाग में किया गया कार्य ... "

"कोरचागिना एवगेनिया विक्टोरोवना चिटोसैन का एकत्रीकरण और पतला जलीय घोल में इसके डेरिवेटिव 02.00.06 - उच्च आणविक भार यौगिक, भौतिक और गणितीय विज्ञान और भौतिक और गणितीय विज्ञान के उम्मीदवार की डिग्री के लिए एक थीसिस का सार मास्को - 2012 काम किया गया था पॉलिमर और क्रिस्टल के भौतिकी विभाग में, भौतिकी के संकाय, मॉस्को स्टेट यूनिवर्सिटी ... "

"वोरोबिवा एकातेरिना जॉर्जीवना चिरल कॉम्प्लेक्स ऑफ पैलेडियम ऑन द नाइट्रोजन-कंटेनिंग डेरिवेटिव्स ऑफ नेचुरल मोनोटेरपेनोइड्स 02.00.03 - ऑर्गेनिक केमिस्ट्री एब्सट्रैक्ट ऑफ द केमिकल साइंसेज के उम्मीदवार की डिग्री के लिए शोध प्रबंध का सार - रसायन विज्ञान संस्थान पर्म - 2011 का काम किया गया था। रूसी विज्ञान अकादमी FGBOU VPO Syktyvkar State University के। वैज्ञानिक सलाहकार: ज़ालेव्स्काया ओल्गा ... "

"Rykunov अलेक्सी अलेक्जेंड्रोविच क्वांटम-टॉपोलॉजिकल एटॉमिक और बॉन्ड डिस्क्रिप्ट्स की सबस्टिट्यूट हाइड्रॉपाइरिमिडीन्स विशेषता 02.00.04 - भौतिक रसायन विज्ञान के रसायन विज्ञान के उम्मीदवार की डिग्री के लिए शोध प्रबंध का सार मास्को -2011 ... डि मेंडेलीव वैज्ञानिक सलाहकार: भौतिक और गणितीय विज्ञान के डॉक्टर, प्रोफेसर ... "

"KORSHUN व्लादिमीर Arkadevich संशोधित PYRIMIDINE न्यूक्लियोसाइड और गैर-न्यूक्लियोसाइड अभिकर्मकों के संश्लेषण में OLIGONUCLEOTIDE संयुग्म, उनके गुण और अनुप्रयोग। न्यूक्लिक एसिड रसायन विज्ञान प्रयोगशालाएं, कार्बनिक संश्लेषण प्रयोगशालाएं और समूह ... "