Диференційна експресія. Диференційна експресія генів

Більшість генів еукаріотів, на відміну від генів прокаріотів мають переривчасту структуру. Відносно короткі діючі ділянки (екзони) чергуються з некодуючими ділянками (інтрони). Регуляторні елементи гена - промотори, що визначають точність ініціації, транскрипції, локалізовані перед першим екзоном на 5" кінці нитки ДНК і представлені декількома елементами (ТАТА-, ССААТ-бокси, GC-мотив).

Експресія генів регулюється також підсилювачами (енхансери), послаблювачами (сайленсори), а також інсуляторами (обмежувачі дії енхансерів) та елементами відгуку, що взаємодіють з факторами транскрипції, ксенобіотиками, стероїдними гормонами та ін. Ці послідовності беруть участь у визначенні частоти.

Перший етап реалізації генетичної інформації – транскрипція. Гени еукаріотів транскрибуються у вигляді попередника, який складається з екзонів та інтронів (незріла іРНК). Потім інтрони вирізують спеціальними ферментами, а екзони послідовно зшиваються один з одним, формуючи готовий для трансляції транскрипт (зріла іРНК). Цей процес отримав назву сплайсинг. Одна й та сама послідовність ДНК може кодувати кілька різних білків, завдяки так званому альтернативному сплайсингу (утворення різних іРНК за рахунок зміни чергування з'єднання екзонів з одного первинного РНК-транскрипта).

Після транскрипції або паралельно з нею незріла іРНК піддається подальшій модифікації. До 5"-кінця пре-іРНК за допомогою ферменту приєднується метильований залишок гуаніну в 7-му положенні пуринового кільця (процес копіювання). Вважається, що кеп (шапочка) необхідна для правильної орієнтації та приєднання рибосом до іРНК перед початком трансляції. К З" -кінцю пре-іРНК також ферментативно приєднується коротка нуклеотидна послідовність, що складається із залишків аденіну (поліаденілювання). Вважають, що поли-А-послідовність необхідна транспорту иРНК через ядерну мембрану в цитоплазму .

За виконуваною функцією у клітині еукаріотичні гени діляться на кілька груп.

Першу групу складають гени, що експресуються у всіх типах клітин. Продукти їх діяльності - білки, необхідні забезпечення життєдіяльності будь-якої клітини організму (гени рибосомальних РНК, гістонів та інших.).

Друга група - тканеспецифічні гени, які функціонують тільки в певних типах клітин або тканинах на певних стадіях онтогенезу (гени глобулінів, альбуміну, а-фетопротеїну, імуноглобулінів, м'язових білків, секреторних білків ендокринних та харчових).

Третю групу становлять гени, які кодують різні білки, що у регуляції транскрипції (транскрипційні чинники). Білкові продукти цих генів взаємодіють із регуляторними ділянками генів, викликаючи посилення чи придушення експресії.

До четвертої групи відносять гени, експресія яких індукується зовнішніми факторами, зокрема ксенобіотиками.

Однією з основних завдань фармакогеноміки є вивчення експресії генів при різних захворюваннях та впливу тих чи інших ліків або біологічно активної сполуки. Це дозволить визначати можливість їхнього спрямованого регулювання.

Успішне впровадження фармакогеноміки в експериментальну фармакологію стало можливим завдяки розвитку відповідних технологій, у тому числі й інформаційних (біоінформатика). Всі вони асимілювали та інтегрували фармакогенетику у широкий науковий напрямок.

В цілому, всі методи ДГЕ складаються з безлічі, часто повторюваних одних і тих самих операцій. Виконання їх вручну малоцікаве заняття. Однак загрозою не є монотонна робота оператора, а значно більшою проблемою вважається нескінченне повторення тих самих операцій, що може призвести до втрати точності. Тому перед фармакогеномічними технологіями стоїть одне завдання – часткова чи повна автоматизація аналітичних операцій.

Основою будь-якої технології є метод, що має в аналітичній практиці свої характеристики (параметри). Для ДДЕ вони повинні відповідати таким вимогам:

Роздільна здатність, пов'язана з певною точністю визначення сусідніх генів;

Чутливість – межа «-послідовностей розведення, що дають можливість статистично достовірно реєструвати зміни ДГЕ;

Охоплення - відсоток експресованих генів даного виду експериментальних тварин або певної тканини, які можуть бути надійно визначені та експериментально повторюватися;

Фальшпозитивна норма – кількість генів, помилково віднесених до експресованих;

Фальшнегативна норма – кількість експресованих генів, проте віднесених до неактивних.

Технології ДГЕ включають дві групи методів. Одна з них, так звана закрита, а друга – відкрита архітектурна система.

Закрита архітектурна система вимагає інформацію про кожен ген або клон і використовує як аналізатор мікрочіпи.

Теорія створення мікрочіпів заснована на гібридизації олігонуклеотидів відомої послідовності, іммобілізованих на твердій поверхні в строго визначених місцях, з міченою різними способами пробою. Сприяли створенню цієї технології останні досягнення в інформатиці, хімії напівпровідників, мікроелектронної промисловості, а також безліч інформації, що накопичилася за роки роботи над програмою «Геном людини».

ДНК-чіп – мініатюрна пластина з мікроосередками. Кожна мікроосередок містить штучно синтезовані олігонуклеотиди, що відповідають фрагментам певних генів, що виступають як матриця. У цих осередках відбувається комплементарна взаємодія матриці та проби (кДНК досліджуваних зразків). В даний час існує два напрямки у створенні ДНК-чіпів. Вони різняться способом синтезу та нанесення матричних олігонуклеотидів.

Перший напрямок заснований на попередньому синтезі олігонуклеотидів. Олігонуклеотиди синтезують хімічно або за допомогою ПЛР (довжина від 500 до 5000 основ) і потім наносять на оброблену спеціальним чином скляну поверхню за допомогою роботів. Такі типи чіпів отримали назву кДНК-мікрочіпів (cDNA-microarray). У ПЛР ампліфікуються послідовності кДНК певних генів. Тому цей тип чіпів дорогий, тому що необхідно створювати власну кДНК-бібліотеку або набувати її у великих дослідницьких центрів.

кДНК-Мікрочіпи виявилися непридатними для проведення досліджень поліморфізму (генетична мінливість окремого локусу в певній популяції), мутаційного аналізу, порівняльного вивчення експресії великої кількості генів, так як щільність розміщення матричних олигонуклеотидов дуже обмежена (число осередків становить = 100). Крім того, застосування довгих фрагментів ДНК (кДНК) знижує специфічність гібридизації з досліджуваною пробою і з'являються хибнопозитивні сигнали, що не відповідають реальній експресії генів.

Незважаючи на перелічені недоліки, основна перевага кДНК-мікрочіпів – можливість варіювання якісним та кількісним складом фрагментів генів.

Більш перспективний напрямок створення чіпів - застосування фотолітографічних технологій, які дають можливість одночасно інтегрувати величезну кількість олігонуклеотидів будь-якої послідовності безпосередньо на поверхні чіпа. Щільність розміщення синтезованих у такий спосіб нуклеотидів може досягати 1 млн. на 1 см2. Такі чіпи, що одержали назви ДНК-чіпів (DNA-chips), виробляються фірмою Affymetrix Inc. Матриця ДНК-чіпа - коротка (20-25-мірна) олігонуклеотидна послідовність, причому кожному гену відповідає 15-20 таких олігонуклеотидів, що значно підвищує точність та відтворюваність результатів. ДНК-чіпи дозволяють одночасно оцінювати експресію практично необмеженої кількості генів, проводити дослідження поліморфізму, у тому числі однонуклеотидних замін (SNP). У цьому випадку синтезуються олигонуклеотиды, специфічні кожної послідовності конкретного гена, враховуючи всі можливі варіанти взаємного розташування нуклеотидів.

При проведенні досліджень чіп гібридизується з міченою різними способами пробою. При порівняльних дослідженнях пробою, як правило, служить кДНК, отримана з контрольного та порівнюваного зразків. Як мітки використовуються як радіоактивно мічені молекули, так і флуоресцентні барвники, що безпосередньо приєднані до досліджуваних зразків. Під час проведення порівняльного аналізу зазвичай застосовують двоколірну детекцію, коли він контрольна і досвідчена кДНК мітяться різними барвниками. Результати реєструють за інтенсивністю гібридизаційних сигналів тих осередків чіпа, де відбулася гібридизація, з подальшою комп'ютерною обробкою даних.

Виробляються й спрощені варіанти чіпів із невеликим набором генів (близько 1000-2000). На нейлоновій мембрані фіксуються короткі послідовності відомих генів. Вони гібридизуються з радіоактивно міченою пробою. Гібридизація детектується шляхом радіоавтографії.

Слід зазначити, що робота з чіпами вимагає спеціального обладнання для проведення гібридизації. Очікується, що найближчими роками ціни на комплекти обладнання для виробництва чіпів та роботи з ними будуть знижені через насичення ринку.

Розробка та впровадження в науку та практику нових технологій часто є рушійним моментом у розвитку медикобіологічних галузей знань, як, наприклад, це було з розробкою в недавньому минулому технології ПЛР. Розвиток молекулярної біології нині багатьом зобов'язане ПЛР, тепер і микрочипам. Використання технології мікрочіпів важливо і для фармакології. Розробка нових лікарських засобів вже зараз починає ґрунтуватися на інформації про функціональну роль певних генів у розвитку патології. Тому терміни розробок можуть скоротитися з 10-15 до 5-8 років. автора Хармар Хіллері

Роль племінного собаки в процесі спарювання Як тільки собака буде достатньо стимульований сукою і захоче її пов'язати, він підіймається на неї і міцно охоплює її передніми ногами, кінчик статевого члена виходить з препуція і після серії сильних спроб приникає в