Більшість генів еукаріотів, на відміну від генів прокаріотів мають переривчасту структуру. Відносно короткі діючі ділянки (екзони) чергуються з некодуючими ділянками (інтрони). Регуляторні елементи гена - промотори, що визначають точність ініціації, транскрипції, локалізовані перед першим екзоном на 5" кінці нитки ДНК і представлені декількома елементами (ТАТА-, ССААТ-бокси, GC-мотив).
Експресія генів регулюється також підсилювачами (енхансери), послаблювачами (сайленсори), а також інсуляторами (обмежувачі дії енхансерів) та елементами відгуку, що взаємодіють з факторами транскрипції, ксенобіотиками, стероїдними гормонами та ін. Ці послідовності беруть участь у визначенні частоти.
Перший етап реалізації генетичної інформації – транскрипція. Гени еукаріотів транскрибуються у вигляді попередника, який складається з екзонів та інтронів (незріла іРНК). Потім інтрони вирізують спеціальними ферментами, а екзони послідовно зшиваються один з одним, формуючи готовий для трансляції транскрипт (зріла іРНК). Цей процес отримав назву сплайсинг. Одна і та ж послідовність ДНК може кодувати кілька різних білків завдяки так званому альтернативному сплайсингу (утворення різних іРНК за рахунок зміни чергування з'єднання екзонів з одного первинного РНК-транскрипта).
Після транскрипції або паралельно з нею незріла іРНК піддається подальшій модифікації. До 5"-кінця пре-іРНК за допомогою ферменту приєднується метильований залишок гуаніну в 7-му положенні пуринового кільця (процес копіювання). Вважається, що кеп (шапочка) необхідна для правильної орієнтації та приєднання рибосом до іРНК перед початком трансляції. К З" -кінцю пре-іРНК також ферментативно приєднується коротка нуклеотидна послідовність, що складається із залишків аденіну (поліаденілювання). Вважають, що поли-А-послідовність необхідна транспорту иРНК через ядерну мембрану в цитоплазму .
За виконуваною функцією у клітині еукаріотичні гени діляться на кілька груп.
Першу групу складають гени, що експресуються у всіх типах клітин. Продукти їх діяльності - білки, необхідні забезпечення життєдіяльності будь-якої клітини організму (гени рибосомальних РНК, гістонів та інших.).
Друга група - тканеспецифічні гени, які функціонують тільки в певних типах клітин або тканинах на певних стадіях онтогенезу (гени глобулінів, альбуміну, а-фетопротеїну, імуноглобулінів, м'язових білків, секреторних білків ендокринних та харчових).
Третю групу становлять гени, які кодують різні білки, що у регуляції транскрипції (транскрипційні чинники). Білкові продуктицих генів взаємодіють з регуляторними ділянками генів, викликаючи посилення чи придушення експресії.
До четвертої групи відносять гени, експресія яких індукується зовнішніми факторами, зокрема ксенобіотиками.
Однією з основних завдань фармакогеноміки є вивчення експресії генів при різних захворюваннях та впливу тих чи інших ліків або біологічно активної сполуки. Це дозволить визначати можливість їхнього спрямованого регулювання.
Успішне впровадження фармакогеноміки в експериментальну фармакологію стало можливим завдяки розвитку відповідних технологій, у тому числі й інформаційних (біоінформатика). Всі вони асимілювали та інтегрували фармакогенетику у широкий науковий напрямок.
В цілому, всі методи ДГЕ складаються з безлічі, часто повторюваних одних і тих самих операцій. Виконання їх вручну малоцікаве заняття. Однак загрозою не є монотонна робота оператора, а значно більшою проблемою вважається нескінченне повторення тих самих операцій, що може призвести до втрати точності. Тому перед фармакогеномічними технологіями стоїть одне завдання – часткова чи повна автоматизація аналітичних операцій.
Основою будь-якої технології є метод, що має в аналітичній практиці свої характеристики (параметри). Для ДДЕ вони повинні відповідати таким вимогам:
Роздільна здатність, пов'язана з певною точністю визначення сусідніх генів;
Чутливість – межа «-послідовностей розведення, що дають можливість статистично достовірно реєструвати зміни ДГЕ;
Охоплення - відсоток експресованих генів даного виду експериментальних тварин або певної тканини, які можуть бути надійно визначені та експериментально повторюватися;
Фальшпозитивна норма – кількість генів, помилково віднесених до експресованих;
Фальшнегативна норма – кількість експресованих генів, проте віднесених до неактивних.
Технології ДГЕ включають дві групи методів. Одна з них, так звана закрита, а друга – відкрита архітектурна система.
Закрита архітектурна система вимагає інформацію про кожен ген або клон і використовує як аналізатор мікрочіпи.
Теорія створення мікрочіпів заснована на гібридизації олігонуклеотидів відомої послідовності, іммобілізованих на твердій поверхні в строго визначених місцях, з міченою різними способами пробою. Сприяли створенню цієї технології останні досягнення в інформатиці, хімії напівпровідників, мікроелектронної промисловості, а також безліч інформації, що накопичилася за роки роботи над програмою «Геном людини».
ДНК-чіп – мініатюрна пластина з мікроосередками. Кожна мікроосередок містить штучно синтезовані олігонуклеотиди, що відповідають фрагментам певних генів, що виступають як матриця. У цих осередках відбувається комплементарна взаємодія матриці та проби (кДНК досліджуваних зразків). В даний час існує два напрямки у створенні ДНК-чіпів. Вони різняться способом синтезу та нанесення матричних олігонуклеотидів.
Перший напрямок заснований на попередньому синтезі олігонуклеотидів. Олігонуклеотиди синтезують хімічно або за допомогою ПЛР (довжина від 500 до 5000 основ) і потім наносять на оброблену спеціальним чином скляну поверхню за допомогою роботів. Такі типи чіпів отримали назву кДНК-мікрочіпів (cDNA-microarray). У ПЛР ампліфікуються послідовності кДНК певних генів. Тому цей тип чіпів дорогий, тому що необхідно створювати власну кДНК-бібліотеку або набувати її у великих дослідницьких центрів.
кДНК-Мікрочіпи виявилися непридатними для проведення досліджень поліморфізму (генетична мінливість окремого локусу в певній популяції), мутаційного аналізу, порівняльного вивчення експресії великої кількості генів, так як щільність розміщення матричних олигонуклеотидов дуже обмежена (число осередків становить = 100). Крім того, застосування довгих фрагментів ДНК (кДНК) знижує специфічність гібридизації з досліджуваною пробою і з'являються хибнопозитивні сигнали, що не відповідають реальній експресії генів.
Незважаючи на перелічені недоліки, основна перевага кДНК-мікрочіпів – можливість варіювання якісним та кількісним складом фрагментів генів.
Більш перспективний напрямок створення чіпів - застосування фотолітографічних технологій, які дають можливість одночасно інтегрувати величезну кількість олігонуклеотидів будь-якої послідовності безпосередньо на поверхні чіпа. Щільність розміщення синтезованих у такий спосіб нуклеотидів може досягати 1 млн. на 1 см2. Такі чіпи, що одержали назви ДНК-чіпів (DNA-chips), виробляються фірмою Affymetrix Inc. Матриця ДНК-чіпа - коротка (20-25-мірна) олігонуклеотидна послідовність, причому кожному гену відповідає 15-20 таких олігонуклеотидів, що значно підвищує точність та відтворюваність результатів. ДНК-чіпи дозволяють одночасно оцінювати експресію практично необмеженої кількості генів, проводити дослідження поліморфізму, у тому числі однонуклеотидних замін (SNP). У цьому випадку синтезуються олигонуклеотиды, специфічні кожної послідовності конкретного гена, враховуючи всі можливі варіанти взаємного розташування нуклеотидів.
При проведенні досліджень чіп гібридизується з міченою різними способами пробою. При порівняльних дослідженнях пробою, як правило, служить кДНК, отримана з контрольного та порівнюваного зразків. Як мітки використовуються як радіоактивно мічені молекули, так і флуоресцентні барвники, що безпосередньо приєднані до досліджуваних зразків. Під час проведення порівняльного аналізу зазвичай застосовують двоколірну детекцію, коли він контрольна і досвідчена кДНК мітяться різними барвниками. Результати реєструють за інтенсивністю гібридизаційних сигналів тих осередків чіпа, де відбулася гібридизація, з подальшою комп'ютерною обробкою даних.
Виробляються й спрощені варіанти чіпів із невеликим набором генів (близько 1000-2000). На нейлоновій мембрані фіксуються короткі послідовності відомих генів. Вони гібридизуються з радіоактивно міченою пробою. Гібридизація детектується шляхом радіоавтографії.
Слід зазначити, що робота з чіпами вимагає спеціального обладнання для проведення гібридизації. Очікується, що найближчими роками ціни на комплекти обладнання для виробництва чіпів та роботи з ними будуть знижені через насичення ринку.
Розробка та впровадження в науку та практику нових технологій часто є рушійним моментом у розвитку медикобіологічних галузей знань, як, наприклад, це було з розробкою в недавньому минулому технології ПЛР. Розвиток молекулярної біології нині багатьом зобов'язане ПЛР, тепер і микрочипам. Використання технології мікрочіпів важливо і для фармакології. Розробка нових лікарських засобів вже зараз починає ґрунтуватися на інформації про функціональну роль певних генів у розвитку патології. Тому терміни розробок можуть скоротитися з 10-15 до 5-8 років. автора Хармар Хіллері
Роль племінного собаки в процесі спарювання Як тільки собака буде достатньо стимульований сукою і захоче її пов'язати, він підіймається на неї і міцно охоплює її передніми ногами, кінчик статевого члена виходить з препуція і після серії сильних спроб приникає в
З книги Службовий собака [Посібник з підготовки фахівців службового собаківництва] автора Крушинський Леонід Вікторович5. Теорія стадійного розвитку та особливості розвитку тварин В основі управління розвитком організмів лежить теорія стадійного розвитку, яку сформулював академік Т. Д. Лисенко, виходячи з роботи І. В. Мічуріна та численних власних досліджень.
З книги Біологія [Повний довідник для підготовки до ЄДІ] автора Лернер Георгій Ісаакович З книги Основи психофізіології автора Олександров ЮрійДиференційна сенсорна чутливість заснована на здатності сенсорної системи до розрізнення сигналів. Важлива характеристика кожної сенсорної системи – здатність помічати відмінності у властивостях одночасно.
З книги Ембріони, гени та еволюція автора Рефф Рудольф А2.12. Диференціальна чутливість зору Якщо на освітлену поверхню з яскравістю I падає додаткове освітлення dI, то, згідно із законом Вебера, людина помітить різницю в освітленості лише якщо dI/I = К, де К – константа, що дорівнює 0,01–0,015. Величину dI/I називають
З книги Акваріум у школі автора Махлін Марк ДавидовичРОЗДІЛ 17 ДИФЕРЕНЦІЙНА ПСИХОФІЗІОЛОГІЯ
З книги Проблеми лікувального голодування. Клініко-експериментальні дослідження [всі чотири частини!] автора Анохін Петро КузьмичЗагибель клітин у процесі нормального розвитку Дегенерація вольфових проток у процесі розвитку особин жіночої статі та мюллерових каналів у особин чоловічої статі – приклади наявності структур, що спочатку розвиваються, а потім піддаються некрозу. Ці процеси,
З книги автораГени, що вступають у дію на більш пізніх стадіях розвитку і в процесі зростання Ясно, що мутації генів, що безпосередньо визначають морфогенетичні шляхи, особливо тих генів, які діють на ранніх стадіях, можуть викликати надзвичайно різкі зміни
З книги автораРозділ 10 Адаптації експресії генів у процесі розвитку Життя - це сила, яка робить безліч експериментів, намагаючись організувати себе... мамонт і людина, миша і мегатерій, мухи і отці церкви - все це результати більш-менш успішних спроб
З книги автораСкільки генів необхідно у розвиток? На щастя, існують методи, що дозволяють оцінити кількість генетичної інформації, що є у вищих організмів. Один із найтонших таких методів – класична менделівська генетика. Головна проблема, пов'язана з цим
З книги автораЗНАЧЕННЯ АКВАРІУМУ В НАВЧАЛЬНОМУ ПРОЦЕСІ Акваріуми завжди приваблюють дітей різного віку, викликають їхнє подив, збуджують допитливість. Але в умовах школи, коли ставиться завдання використовувати акваріум під час уроків ботаніки, зоології, загальної; біології, його
З книги автораСтан хворих у процесі лікування На підставі клінічних спостережень та лабораторних досліджень у динаміці клінічного стану хворих у процесі лікування можна було відзначити 6 стадій, з яких 3 відносяться до розвантажувального періоду та 3 – до відновного.
Загальне уявлення про зростання та розвиток
Про зростання рослин, здавалося б, можна судити щодо збільшення загальної біомаси. Однак цей показник дуже неоднозначний, оскільки сира біомаса може не лише збільшуватись, а й зменшуватись. Ще один показник зростання – це збільшення кількості клітин. Якщо число клітин зростає, можна впевнено говорити про зростання, але постійне число клітин ще не говорить про відсутність зростання: у зоні розтягнення збільшення кількості клітин незначне, проте зростання йде. Про зростання можна будувати висновки щодо збільшення лінійних розмірів – висоти рослини, довжини кореня, ширини листа тощо.
Таким чином, зростанням можна називати необоротне збільшення рослини хоча б за одним із параметрів: число клітин, лінійні розміри, сира/суха біомаса.
Спрощеною моделлю зміни параметрів зростання часу є «крива зростання». Більш детально я говоритиму про неї нижче. Слід лише відзначити, що характер цієї кривої здатний різко змінюватись, у зв'язку з дією на рослину маси зовнішніх факторів. Загальна крива зростання, часто виявляється складеною різномаштабними S - подібними ділянками. Таким чином, крива росту цілої рослини зазвичай має складнішу форму.
Диференціювання
Термін диференціювання був введений для позначення процесу набуття відмінностей між клітинами (тканинами, органами, системами органів тощо). Передбачається, що є початковий недиференційований стан, коли спостерігач не може встановити відмінності між клітинами, потім з'являються видимі відмінності клітин і стають диференційованими. Традиційно недиференційованими вважають: клітини ембріона, що діляться; меристематичні клітини апексів кореня та стебла, камбію, фелогену, інтеркалярних меристем; клітини, що неорганізовано діляться в експериментальних умовах (суспензійна та калусна культура in vitro).
Клітини, що залишили зону поділу, приступають до диференціювання. Результат цього процесу можна побачити, наприклад, при утворенні провідної системи: виникає прокамбій, який диференціюється на флоему, ксилему та камбій. У флоемі диференціюються ситовидні елементи і клітини-супутниці, в ксилемі - паренхімні клітини і трахеїди, пучок, що проводить, може бути посилений механічними тканинами, що диференціюються, і т.д. У цьому прикладі клітини поетапно набувають анатомічних відмінностей у зв'язку з виконуваними функціями, різноманіття клітин зростає.
Анатомічному диференціюванню передує біохімічне диференціювання, коли видимих відмінностей між клітинами мало, але вони не однакові за вмістом тих чи інших речовин. Найзручніше стежити за диференціальною еспресією генів: появою нових або зниженням рівня старих мРНК та білків. Ці дані дозволяють зареєструвати різницю між клітинами раніше, ніж вони стануть видимими на анатомічному рівні. Таким чином, диференціювання починається із зміни активності геному, експресії одних генів та придушення активності інших.
При такому підході клітини меристеми, що діляться, доведеться вважати диференційованими, так як для проходження клітинного циклу потрібна певна активність геному, яка і відрізнятиме ці клітини від інших. Анатоми давно звернули увагу на неоднорідність клітин меристеми. Можна сказати, що апікальна меристема кореня диференційована на калітроген (ініціалі чехлика), дерматоген (ініціалі епідермальної тканини), ініціалі кори, центр, що покоїться, і ініціалі осьового циліндра. Для кожної з груп клітин, що діляться, характерні певна локалізація, напрям веретена поділів і тип похідних клітин. Дослідження меристеми методами молекулярної генетики показує, що виявлена анатомами диференціювання меристеми на зони співпадає із зонами диференціальної експресією певних генів. Понад те, саму меристему загалом можна чітко виділити по зонам диференціальної експресії. Таким чином, меристема є біохімічно диференційованою тканиною.
Диференціальна експресія генів - фундаментальне прояв диференціювання, і, хоч як це парадоксально, недиференційованих клітин взагалі немає. Поняття «недиференційований» добре працює лише там, де відповідно до завдань дослідження вихідні відмінності між клітинами не враховують (або немає методів їх виявити).
Генетичний аналіз процесу розвитку передбачає його розкладання ряд проміжних етапів, кожен із яких контролюється певної генетичної системою. Розвиток є результатом спільної, можливо змінює одна одну активності двох генетичних систем – первинної та вторинної. Під первинною системою розуміється генетичний контроль, що жорстко регламентує перехід системи, що розвивається, з одного стану в інший, а під вторинною генетичною регуляцією – здатність системи досягати деякого кінцевого стану автоматично або авторегуляторно.
Геноконтрольовані етапи є критичними періодами у розвитку біологічної системиоскільки саме тут відбуваються докорінні зміни, пов'язані з формуванням морфофункціональної структури та визначення принципів регулювання. У ці періоди створюються передумови негеноконтрольованих переходів системи, в яких вона зберігає свої якісні характеристики та властивості, а також демонструє низьку чутливість до зовнішніх та внутрішніх змін умов розвитку.
Отже, диференціюванням можна назвати процес зміни профілю генної активності, що призводить до подальшої зміни функції клітин.
Тотипотентність
В ембріології тварин процес диференціювання зображують як складний «ландшафт», яким котиться «куля». Куля – це символ клітини, що дає початок новому організму. У розвилках куля «здійснює вибір» і скочується по одній із кількох можливих траєкторій. Так і клітини, що виникли при розподілі зиготи, прямують по одному з можливих шляхів диференціювання. У цьому клітини втрачають «морфогенетичний потенціал». Усі «траєкторії» закінчуються в «морі», що символізує смерть організму.
Якщо на початку шляху у "кулі" - клітини багато потенційних можливостей, то в міру наближення до "моря" їх стає дедалі менше.
На ім'я вченого, який запропонував таку аналогію, її називають морфогенетичним ландшафтом Уоддінгтона.
Процес диференціювання рівносильний втраті морфогенетичного потенціалу.
На відміну від клітин тварин більшість клітин рослин після анатомічного диференціювання легко переходять до поділу. Такий процес називають дедиференціюванням (втратою спеціалізації). При механічному пошкодженні рослини, а також в умовах експерименту дедиференціювання призводить до утворення калюсу.
З більшості клітин можна отримати новий організм (для клітин тварин це неможливо). Практично будь-яка клітина багатоклітинного організму містить повний набір генів, необхідний формування організму, проте кожна клітина може дати початок цілому організму. Властивість клітини реалізувати наявну генетичну інформацію та дати початок цілому організму називають тотипотентністю. Тотипотентність клітин рослини порівняно легко реалізувати, тоді як більшість тварин клітин не можуть утворити новий організм. Таким чином, поняття диференціювання як зниження морфогенетичного потенціалу, запозичене з ембріології тварин, не застосовується до тотипотентних рослинних клітин, оскільки їхній морфогенетичний потенціал довго залишається високим.
Ідея про тотипотентність рослинної клітини була висунута Г. Хаберландтом ще в 1902 р., хоч і не отримала тоді експериментального підтвердження. Згідно з визначенням Хаберландта, будь-яка клітина рослини може дати початок новому організму, і якщо цього не спостерігається, то лише тому, що рослинний організм пригнічує потенції клітини до розвитку. Ізоляція клітин від рослин сприяє прояву цих потенцій.
