Дослідження фармакокінетики та біодоступний - журнал фармакокінетика та фармакодинаміка. З використанням оф вежх та капілярного Хроматографія амінокислот та пептидів

Транскрипт

1 НОВОСИБІРСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ УНІВЕРСИТЕТ Факультет природничих наук Кафедра аналітичної хімії Курсова роботаПророцтво обсягів утримування та УФ спектрів пептидів в обернено фазовій ВЕРХ Виконала: Кучкіна А.Ю., гр. 147 Науковий керівник: к.х.н. Азарова І.М. Новосибірськ-2005

2 ЗМІСТ 1. Вступ Літературний огляд 2.1. Пептиди. Амінокислоти ВЕРХ пептидів Передбачення обсягів утримування та УФ спектрів пептидів в ОФ ВЕРХ Експериментальна частина Результати та їх обговорення 4.1. Контроль стабільності роботи хроматографічної системи Обчислення об'ємів утримування пептидів Лінійна модель «склад утримання» Нелінійна модель «склад утримування» Обчислення УФ спектрів пептидів Висновки Література Додаток

3 1. ВСТУП Ідентифікація функціонуючих у живих клітинах білків на основі відомої інформації про структуру геному протеоміка – вважається одним із найважливіших завдань сучасної молекулярної біології. Ця проблема виникла після повної розшифровки геномів деяких організмів останні кілька років. Виявилося, що геноми кодують набагато більше білків, ніж їх продукує. Ідентифікація білка, що цікавить, у сумі всіх білків є найскладнішим методичним завданням, не вирішуваним, як правило, прямим методом. Один з підходів до вирішення такого роду завдань, названий пептидомікою, полягає в тому, що суму білків гідролізують специфічною протеазою, і суму пептидів, що утворилися, розділяють методами капілярного електрофорезу або високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ). Кінцевим завданням є виявлення пептиду (пептидів) відомої будови, що є (є) апріорі фрагментом білка, що кодується геномом досліджуваного організму. Якщо такий пептид (пептиди) визначається зразком, то робиться висновок про те, що даний білок організмом продукується. Методичні проблеми, що виникають під час вирішення таких завдань, можна розділити на 2 групи. Перша проблема поділу суміші, що складається, як правило, із кількох тисяч пептидів. Друге визначення структури виділених індивідуальних пептидів. Проблема поділу вирішується фракціонуванням первинної суміші з подальшим поділом виділених фракцій на індивідуальні компоненти. Друга проблема вирішується головним чином мас-спектрометричними методами, які в кінцевому підсумку дозволяють визначити молекулярні маси індивідуальних компонентів (пептидів). Якщо пептид має досить «унікальну» структуру (набір амінокислот) до таких відносяться, як правило, довгі (понад амінокислотних залишків) пептиди -, то його молекулярна маса так само буде «унікальна», і ймовірність помилкової ідентифікації стає дуже малою. Так як процедура поділу пептидів націлена на виділення пептиду з відомим набором амінокислот, виникає питання: чи не можна передбачити час виходу такого пептиду з ВЕРХ колонки, знаючи його амінокислотний склад? Вперше такий підхід продемонстрували на початку 80-х років. Метою цього дослідження була розробка методики передбачення обсягів утримування пептидів на хроматографі «Міліхром А-02» в режимі зверненофазової ВЕРХ (ОФ ВЕРХ) з використанням рухомої фази, придатної для прямого введення мас-спектрометр. 3

4 2. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ 2.1. Пептиди. Амінокислоти Пептиди це біополімери, побудовані із залишків α-амінокислот, з'єднаних між собою пептидними зв'язками (-NH-CO-). Загальну формулу пептиду можна подати у такому вигляді: NH 2 CH CO NH CH CO... NH CH R 1 R 2 Rn Між білками та пептидами немає чіткої межі, як правило, до пептидів відносять біополімери, що містять не більше 100 амінокислотних залишків. Амінокислоти – це будь-які органічні кислоти, до складу молекул яких входить аміногрупа, часто під цією назвою мають на увазі саме α-амінокислоти, т.к. вони мають важливе біологічне значення. Молекули більшості природних амінокислот, що входять до складу білків, мають загальну формулу H 2 NCH R Як видно із структурної формули, амінокислоти (за винятком проліну) відрізняються один від одного тільки структурою бічного ланцюга R. Амінокислоти є амфотерними сполуками, оскільки до складу їхньої молекули входить як кислотна карбоксильна група, так і основна аміногрупа. У сильнокислому середовищі карбоксильна група переважно недисоційована, а аміногрупа протонована. У сильнолужному середовищі аміногрупа знаходиться у вигляді вільної основи, а карбоксильна група у вигляді карбоксилат-аніону. У кристалічному стані амінокислоти існують у вигляді цвіттер-іона, де протон з карбоксильної групи перенесений на аміногрупу. У біосинтезі природних пептидів та білків беруть участь лише 20 амінокислот. Амінокислоти та його властивості наведено у таблиці 1. Таблиця 1. Амінокислоти та його свойства. Назва амінокислоти Код Структура рк а - -NH 2 -R Гліцин G H 2,35 9,78 Аланін A H 3 C 2,35 9,87 Валін V H 3 C CH CH 3 2,29 9,74 4

5 Назва амінокислоти Код Структура рк а - -NH 2 -R Лейцин LH 3 C CH CH 3 2,33 9,74 Ізолейцин IH 3 C * CH CH 3 2,32 9,76 H 2 C Пролін P HC NH 1,95 10,64 Фенілаланін F 2,20 9,31 Триптофан WNH CH NH 2 2,46 9,41 Тирозин Y HO CH NH 2 2,20 9,21 10,46 Серін S HO 2,19 9,21 Треонін T HO * CH CH 3 2,09 9,10 Цистеїн C HS 1,92 10,70 8,37 Аспарагінова кислота D HOOC 1,99 9,90 3,36 Глутамінова кислота E HOOC 2,10 10,47 4,07 Аспарагін NH 2 NCO 2,14 8,72 Глутамін QH 2 NCO 2,17 9,13 Лізин KH 2 N 2,16 9,06 10,54 Аргінін RH 2 NC NH 1,82 8,99 12,48 NH Гістидин HN NH 1, 80 9,33 6,04 Метіонін MH 3 CS 2,13 9,28 5

6 Залежно від характеру бічних ланцюгів, амінокислоти поділяються на дві групи: амінокислоти з неполярними (гідрофобними) аліфатичними або ароматичними R-групами; амінокислоти з полярними (гідрофільними) R-групами. До першої групи відносять 8 амінокислот: аланін, валін, лейцин, ізолейцин, метіонін, пролін, фенілаланін, триптофан. Сім амінокислот містять у боковому ланцюзі угруповання, здатні нести негативний або позитивний заряд: аспарагінова та глутамінова кислоти при pH 7,0 заряджені негативно; лізин, аргінін, гістидин, основні амінокислоти, бічні ланцюги яких можуть бути заряджені позитивно; у лужних умовах негативно зарядженими можуть бути бічні групи тирозину та цистеїну ВЕРХ пептидів Поділ сумішей пептидів є дуже складним завданням. В даний час ОФ ВЕРХ є найважливішим методом поділу пептидів. Пептиди є полярними речовинами, що перешкоджає їх взаємодії з поверхнею гідрофобної нерухомої фази і призводить до взаємодії з залишковими силанольними групами. Для того, щоб зменшити взаємодію з силанольними групами, елюенти додають сильні кислоти або солі. Для зменшення полярності пептидів хроматографування слід проводити за низьких значень ph (нижче 3). Якщо слідувати цим принципам, то ВЕРХ виявиться дуже гнучким способом поділу пептидів. Це зумовлено тим, що цей метод характеризується високою швидкістю поділу, відтворюваністю результатів та можливістю проведення аналізу мікрограмових кількостей речовин. Ще однією перевагою ОФ ВЕРХ є можливість збору фракцій у малому обсязі летких розчинників, що спрощує подальше проведення мас спектрометричного аналізу. Як правило, як леткі розчинники використовують 0,1% - трифтороцтову і мурашину кислоти. Трифтороцтова кислота прозора в УФ області до 205 нм, що є великою перевагою при хроматографуванні складних сумішей. Крім того, пептиди добре розчиняються в трифтороцтовій кислоті. Елюювання пептидів із навернених фаз, як правило, проводиться в градієнтному режимі з додаванням органічного модифікатора. Найпоширеніший органічний модифікатор ацетонітрил. Він прозорий в УФ області до 200 нм і характеризується гарною селективністю. 6

7 Ще одним фактором, що зумовлює широке застосування ОФ ВЕРХ для аналізу пептидів, є можливість передбачення їх хроматографічної поведінки. амінокислотний склад, вперше висловив J. Meek. Утримання пептидів на зверненій фазі визначається гідрофобністю амінокислотних залишків, що входять до їх складу. Амінокислоти з ароматичним або великим аліфатичним ланцюгом роблять основний внесок у утримання. Виходячи з вищесказаного, Meek запропонував розраховувати обсяги утримання пептидів на зверненій фазі як суму вкладів залишків амінокислот, що входять до складу пептиду. Їм була запропонована лінійна (адитивна) модель «складу утримання»: V R = V 0 + Z N * + Z C * + Z i (1) де V R обсяг утримання пептиду; v 0 - вільний обсяг колонки; Z N* та Z C* відповідно вклади вільних -NH 2 та - або модифікованих кінцевих груп пептиду; Z i - Внесок i-тої амінокислоти (константа утримування). Meek проводив хроматографування 25 пептидів в умовах градієнтної ОФ ВЕРХ і, вирішуючи обернену задачу, обчислював константи утримання амінокислот. Коефіцієнти кореляції залежності V R (відч.) = f (v R (експ.)) склали 0,997 (при ph 2,1) та 0,999 (при ph 7,4). Незважаючи на високі коефіцієнти кореляції, дана модель суперечить фізичному сенсу, оскільки отримані таким чином константи утримування амінокислот не відображають реальних відмінностей у їхній гідрофобності і деякі з вкладів мають негативні значення. Крім того, існує безліч фактів, згідно з якими зі зростанням кількості амінокислотних залишків у пептиді поверхня його гідрофобного контакту з навернутою фазою, що визначає утримання, збільшується нелінійно. Авторами роботи також було прийнято припущення, згідно з яким обсяги утримання пептидів розраховуються із суми вкладів амінокислотних залишків. Для розрахунку обсягів утримування пептидів ними була запропонована наступна модель: V R = A * ln (1 + Z j * n j) + B (2) 7

8 де Z j - емпіричний параметр утримування, який розраховують, виходячи з гідрофобності амінокислот; A та B константи; n j – число амінокислотних залишків j у пептиді. Ця модель дає хорошу кореляцію між розрахунковими та експериментальними обсягами утримування пептидів. Недолік моделі полягає в тому, що вона справедлива лише для конкретної хроматографічної системи (лінійний градієнт із заданою крутістю, фіксовані швидкість потоку, рухлива та нерухома фази). Таким чином, застосування цієї моделі дуже обмежене. Тому авторами роботи була запропонована інша модель, заснована на теорії градієнтної елюції, яка дозволяє розраховувати обсяги утримання пептидів для ширшого кола хроматографічних систем. Враховуючи, що доступна площа гідрофобного контакту пептиду з нерухомою фазою змінюється пропорційно його молекулярній масі в ступені 2/3, автори підібрали функцію для розрахунку обсягів утримування пептидів: VR = f(3) де a, b, c константи, що залежать від властивостей конкретної хроматографічної системи, визначалися експериментально з даних хроматографування 15 обраних для цієї мети пептидів. Коефіцієнт кореляції залежності V R (відмін.) = f (v R (експ.)) Склав 0,98. Істотним недоліком, який обмежує застосування цього методу, є необхідність обчислення констант a, b і c для конкретної хроматографічної системи попередніх експериментів з модельними пептидами, що є дуже трудомісткою процедурою. У роботі обчислювали обсяги утримування та УФ спектри пептидів з відомою амінокислотною послідовністю, попередньо визначивши вклади амінокислот у вищезазначені параметри. Величини цих вкладів знаходили експериментально з хроматограм розчинів індивідуальних амінокислот, отриманих при багатохвильовому фотометричному детектуванні в тих умовах, в яких хроматографувалися пептиди. Автори роботи запропонували наступне рівняння для обчислення обсягів утримування пептидів: V R = 209 [(Z i) + Z C + N * + V 0 ] 1/3 990 (4) де Z i коефіцієнт утримання амінокислоти «i»; V 0 вільний обсяг колонки; Z C*+N* сумарна константа утримання кінцевих груп пептиду. При обчисленні УФ спектрів пептидів розглядали спектр пептиду як суму спектрів його структурних елементів. Для перевірки запропонованого методу було 8

9 хроматографовані 30 пептидів, коефіцієнт кореляції між обчисленими і експериментально знайденими обсягами утримування склав 0,95. Запропонований спосіб обчислення УФ спектрів пептидів також має задовільну передбачувану силу. У аналізованої роботі як елюенти використовували ацетонітрил і водний розчин перхлорату літію (0,2М LiCLO М HClO 4), що є нелетючою речовиною, що робить наступну мас-спектрометричну ідентифікацію пептидів дуже складною. Тому нам здалося доцільним розробити метод, використовуючи рухливу фазу складу ацетонітрил - трифтороцтова кислота, всі компоненти якої є леткими речовинами і не заважають проведенню мас-спектрометричного аналізу. 9

10 3. ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА ВЕРХ проводили на хроматографі «Міліхром А-02» на колонці 2х75 мм з фазою ProntoSIL C 18 AQ («Bischoff Analysentechnik und Geräte GmbH», Німеччина) у таких умовах: елюент А: 0, 0; елюенти Б: ацетонітрил; лінійний градієнт: 40 хв. від 5 до 100% Б; швидкість потоку: 100 мкл/хв; температура колонки: 40°С; детекція: при 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280 та 300 нм, τ = 0,18 с; об'єм проби: 4 мкл. Розчин для тестування хроматографічної системи: KBr – 0,2 мг/мл; урідін – 0,2 мг/мл; кофеїн-1 мг/мл; м-нітроанілін – 0,1 мг/мл; про-нітроанілін-0,1мг/мл; розчинник 2% ацетонітрилу у воді. Усі реактиви з масовою часткою основної речовини не менше 98%. У роботі використовували амінокислоти (Serva, Німеччина), ацетонітрил «Сорт 0» (НВФ «Кріохром», м. Санкт-Петербург), безводну трифтороцтову кислоту (ICN Biomedicals, США). Зразки пептидів були люб'язно надані В.В. Самукова (НВО «Вектор», м. Новосибірськ) та І.В. Назимова (ІБХ РАН, м. Москва). Концентрації амінокислот у хроматографованих розчинах становили 0,2 1 мг/мл, пептидів 0,1 2 мг/мл. Обробку хроматограм проводили за допомогою програми "Мультихром" (ЗАТ "Амперсенд", м. Москва). Для обчислення V R, площ хроматографічних піків при детектуванні на 8 довжинах хвиль (S λ) та графічного представлення хроматограм пептидів використовували програму ХРОМ П (ЗАТ Інститут хроматографії ЕкоНова, м. Новосибірськ). Лінеаризацією кривої, наведеної на малюнку 1, проводили за допомогою програми Microsoft Excel (Microsoft Corporation,). 10

11 4. РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ 4.1. Контроль за стабільністю роботи хроматографічної системи Контроль за стабільністю роботи хроматографічної системи проводили з використанням процедури, регламентованої методикою . Хроматографували тестовий розчин і з отриманих хроматограм обчислювали 14 параметрів, кожен з яких контролює певний показник хроматографічної системи: V бромід-іону вільний обсяг колонки; спектральне відношення S 280 /S 250 урідина точність налаштування детектора в діапазоні від 250 до 280 нм; спектральне відношення S 260 /S 280 кофеїну лінійний діапазон детектора; спектральне відношення S 260 /S 230 м- нітроаніліну придатність елюенту А. По піку о-нітроаніліну контролювали: VR відхилення градієнта від заданої форми, спектральні відносини точність налаштування детектора в діапазоні від 210 до 300 нм, асиметрія піку A 10% порушення , S 210 точність дозування зразка. Періодичне вимірювання хроматографічних та спектральних параметрів модельного розчину дозволило нам переконатися у відтворюваності роботи використовуваної хроматографічної системи. Результати тестування наведено в таблиці 2. Таблиця 2. Результати тестування хроматографічної системи, n = 8. Речовина Параметр 11 Середнє значення параметра S r (%) Бромід VR, мкл 148 1,0 Урідін S 280 /S 250 0,53 1,3 Кофеїн S 260 /S 280 0,73 0,6 м-нітроанілін S 260 /S 230 0,80 1,0 про-нітроанілін VR, мкл,6 S 220 /S 210 1,71 0,5 S 230 /S 210 1,76 0,7 S 240 /S 210 1,11 0,6 S 260 /S 210 0,58 0,9 S 250 /S 210 0,40 1,4 S 280 /S 210 0,59 0,9 S 300 /S 210 0,32 1,2 A 10% 1,05 1,1 Вихідний сигнал (площа піку) S 210, е.о.п. мкл 25,00 1,4

12 Отримані значення S r дозволяють зробити висновок про стабільність роботи описуваної хроматографічної системи. обчислювали за рівнянням: Z i = V Ri V 0 ZC*+N* (5) де V Ri обсяг утримування амінокислоти «i»; V 0 вільний обсяг колонки (об'єм утримування Br -, у даній хроматографічній системі він становив 148 мкл); Z C+N сумарна константа утримання кінцевих груп пептиду. Z C+N обчислювали за рівнянням: ZC*+N* = VR (G) V 0 ((6) де VR (G) об'єм утримування гліцину, мкл; VR (GGG) і v R (GG) об'єми утримування пептидів , мкл Суму коефіцієнтів утримання кінцевих груп [(-NH 2) + (-CONH 2)] вважали рівною сумі коефіцієнтів утримування груп [(-NH 2) + (-)] Хроматографічні дані та обчислені константи утримування структурних елементів пептидів наведені в табл. - 25 R

13 Лінійна модель «склад утримування» Для передбачення обсягів утримування пептидів у рамках лінійної моделі запропонованої в роботі ми обчислили обсяги утримування 28 пептидів (табл. 4) і порівняли отримані дані з даними, знайденими експериментально (рис. 1). Таблиця 4. Експериментально знайдені та обчислені обсяги утримання пептидів (лінійна модель). Пептид VR (эксп.), мкл VR (выч.), мкл 1 GG GGG AS GRGDS TKPR WAGGDASGE GL MY KPVGKKRRPVKVYP WD-YGGDASGE WD-AGGDA NCMLDY SYSMEHFRWG WD-VGGDASGE YGGFLRKYPK RPPGFSPFR MEHFRWG RVYIHPF YGGFLRRIRPKLK YGGFM DRVYIHPF QATVGDINTERPGMLDFTGK ELYENKRPRRPYIL DRVYIHPFHL YD-AGFL RPKPQQFFGLM -NH PQQFFGLM-NH GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH

14 V VR R(відмін.), мкл VR(експ.), R мкл Рис. 1. Порівняння експериментально знайдених та обчислених обсягів утримання пептидів. Обчислення значень V R проводили за рівнянням (1). Як видно з отриманих даних, лінійна модель дає задовільні результати лише відносно гідрофільних пептидів; для гідрофобних пептидів обчислені значення виявляються помітно вищі за експериментальні. Подібні результати були отримані в роботі Лінеаризація кривої, наведеної на рис. 1, дає рівняння: V R = 173 [(n Z i) + V 0 ] 1/3 785 (7) Порівняння обчислених значень та знайдених експериментально обсягів утримування для 28 пептидів показано в таблиці 5 та на рис

15 V R (відмін.), мкл VR VR (експ.), мкл V R Рис. 2. Порівняння експериментально знайдених та обчислених обсягів утримання пептидів. Обчислення значень V R проводили за рівнянням (7). 15

16 Таблиця 5. Експериментально знайдені та обчислені обсяги утримання пептидів (нелінійна модель). Пептид VR (эксп.), мкл VR (выч.), мкл 1 GG GGG AS GRGDS TKPR WAGGDASGE GL MY KPVGKKRRPVKVYP WD-YGGDASGE WD-AGGDA NCMLDY SYSMEHFRWG WD-VGGDASGE YGGFLRKYPK RPPGFSPFR MEHFRWG RVYIHPF YGGFLRRIRPKLK YGGFM DRVYIHPF QATVGDINTERPGMLDFTGK ELYENKRPRRPYIL DRVYIHPFHL YD-AGFL RPKPQQFFGLM -NH PQQFFGLM-NH GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH Коефіцієнт кореляції залежності VR (відч.)=f(v R (експ.)) становив 0,96. У Додатку наведено експериментальну та обчислену хроматограми модельної суміші 11 пептидів. 16

17 4.3. Обчислення УФ спектрів пептидів Питомі спектральні коефіцієнти структурних елементів пептидів були з роботи , т.к. у використовуваній нами хроматографічній системі коректному обчисленню спектральних відносин заважають системні піки, а також слабке утримання гідрофільних амінокислот та коротких пептидів. Значення питомих спектральних коефіцієнтів наведено в таблиці 6. Таблиця 6. Спектральні коефіцієнти поглинаючих УФ випромінювання структурних елементів пептидів як площі хроматографічних піків при С = 1 мм та обсяг проби 4 мкл, (е.о.п. мкл) . λ, нм W F Y H C M R Q N E D N*+C* ПС де S C*+N* спектральні коефіцієнти суми груп (-NH+-) пептиду, S ПС поглинання пептидного зв'язку. Спектральні характеристики пептидів як площі їх хроматографічних піків при С=1мМ та обсязі проби 4 мкл обчислювали за рівнянням: a λ пептид = a λ N*+C* + (m-1) а λ λ ПС + ai (9) де m загальне число амінокислотних залишків у пептиді, a λ N*+C* умовна площа піку кінцевих груп пептиду, а λ ПС - питоме поглинання пептидного зв'язку при довжині хвилі λ, ai - спектральні характеристики амінокислотних залишків для довжини хвилі λ. Величини, що входять до рівняння (9), були отримані в такий спосіб. Обчислювали питомі спектральні характеристики структурних елементів пептидів при довжині хвилі λ=210 нм (а 210 i) як площі їх хроматографічних піків для розчину з концентрацією 1мМ та обсягу проби 4 мкл за рівнянням: a 210 i = a 210 АК a 210 *, (10) де a 210 АК площа піку амінокислоти; a 210 N*+C* умовна площа піку кінцевих груп пептиду. Величину a 210 N*+C* брали рівною a 210 Leu, тому що групи NH 2 є єдиними хромофорами Leu в діапазоні довжин хвиль нм. 17

18 Питоме поглинання пептидного зв'язку (а 210 ПС) обчислювали як різницю питомих поглинань пептидів GGG та GG: a 210 ПС = а GGG а GG (11) Спектральні характеристики для довжини хвилі λ обчислювали за рівнянням: a λ i = a 2 λ /S 210), (12) де S λ /S 210 спектральні відносини амінокислот і пептидів GG і GGG, що становлять відносини площ піків при довжинах хвиль λ до площі піку при λ = 210 нм. У таблиці 7 наведено порівняння обчислених спектральних відносин S λ /S 210 для 28 пептидів з отриманими експериментально. Експериментально отримані та обчислені спектральні відносини пептидів досить добре узгоджуються між собою. Найчастіше відмінності становлять трохи більше 0,06. Для деяких пептидів (5, 9, 12, 16, 18, 22, 23, 26, 27) спостерігаються помітніші відмінності передбачених та експериментальних спектральних відносин. Причини цих відмінностей потребують додаткових досліджень. Таблиця 7. Порівняння експериментальних та обчислених величин спектральних відносин пептидів. Пептид Значення Спектральні відносини S λ /S 210 для довжин хвиль λ(нм): Вич Експ Відч Експ Вич Експ Вич Експ Вич Експ Вич Експ Вич Експ

19 Пептид Значення Спектральні відносини S λ /S 210 для довжин хвиль λ(нм): Гл Експ Гл Експ Гл Експ Гл Експ Гр Експ Гр Експ Гр Експ Гр Експ Гр Експ Гр Експ Гр Експ Гр Експ Гр Експ Гр Вич Експ Вич Експ

20 Пептид Значення Спектральні відносини S λ /S 210 для довжин хвиль λ(нм): Вич Експ Вич Експ З отриманих даних видно, що описуваний метод обчислення обсягів утримування пептидів відомого складу та їх УФ спектрів в умовах градієнтної ОФ ВЕРХ має задовільно може бути корисним при проведенні досліджень, пов'язаних з поділом сумішей пептидів. 20

21 5. ВИСНОВКИ 1. Розроблено метод, що дозволяє передбачати обсяги утримання пептидів відомого складу в режимі градієнтної ОФ ВЕРХ на хроматографі «Міліхром А-02» з використанням леткої рухомої фази, придатної для прямого введення виділених фракцій мас-. 2. Розроблено метод розрахунку оптичного поглинання пептидів при довжинах хвиль 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280 та 300 нм безпосередньо у рухомій фазі, що застосовується для поділу пептидів. 3. Розроблені методи апробовано для 28 модельних пептидів. Коефіцієнт кореляції обчислених обсягів утримування з відповідними експериментальними величинами становив 0,96. Розбіжність обчислених та експериментально отриманих спектральних відносин S λ / S 210 становило не більше 0, ЛІТЕРАТУРА 1. Рєзніков В.А., Штейнгарц В.Д. амінокислоти. Новосибірськ: НГУ, З Досон Р., Елліот Д., Елліот У., Джонс К. Довідник біохіміка. Москва: Мир, с. 3. Овчинніков Ю.А. Біоорганічна хімія. Москва: Просвітництво, c. 4. Високоефективна рідинна хроматографія у біохімії (за ред. Хеншен А.). Москва: Світ, с. 5. Meek JL. // Proc. Natl. Acad. Sci. США. 1980, V. 77. No.3. P Sakamoto Y., Kawakami N., Sasagawa T. // J. Chromatogr V P Sasagawa T., Okuyama T., Teller D.C. // J. Chromatogr V P Browne C.A., Bennet H.P.J., Solomon S. // Anal. Biochem V.124. P Meek JL, Rossetti Z.L. // J. Chromatogr V P Азарова І.М., Барам Г.І., Гольдберг Є. Л. // Біоорганічна хімія. У пресі. 11. Масова концентрація УФ-поглинаючих речовин. Методика виконання вимірювань методом високоефективної рідинної хроматографії. ФР Іркутськ

22 7. Додаток Експериментальна (А) та обчислена (Б) хроматограми суміші 11 пептидів. Номери пептидів відповідно до табл А 0,5 е.о.п нм Б нм Об'єм, мкл

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ РОСІЙСЬКОЇ ФЕДЕРАЦІЇ ФЕДЕРАЛЬНЕ АГЕНТСТВО З ОСВІТИ НОВОСИБІРСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ УНІВЕРСИТЕТ Факультет природничих наук

Лекція 1: Первинна структура білків - амінокислоти 1 Різноманітність білків Багато біологічних функцій організму здійснюється білками. Ці функції включають перенесення і зберігання кисню (гемоглобін

273 УДК 543. 544 РОЗДІЛ ВИРОБНИЧИХ ЕНАНТІОМЕРІВ АМІНОКИСЛОТ НА АМІНОВАНОМУ β-циклодекстрині МЕТОДОМ ВИСОКОЕФЕКТИВНОЇ РІДКОСТНОЇ ХРОМАТОГРАФІЇ О. А., А. А., А. А., А. А., А. А., А. А., А. А., А. А.

1. Ковалентні зв'язки у білках та ферментах. Наведіть приклади. КВИТОК 1 2. На чому ґрунтується поділ білків фракціонуванням у присутності різних концентрацій солей. Від яких домішок цей метод дозволяє

Тема 23. Аміни. Амінокислоти та пептиди Зміст теми: Аміни, їх класифікація та номенклатура. Способи отримання та Хімічні властивостіамінів. Анілін, його електронна будова. Залежність основних властивостей

Т.П. Вавілова А.Є. Медведєв Біологічна хімія Біохімія ротової порожнини Підручник Міністерство освіти і науки РФ Рекомендовано ГБОУ ВПО «Перший Московський державний медичний університет імені

Московський фізико-технічний інститут (Державний університет) Департамент молекулярної та біологічної фізики Фізичні методи дослідження Лекція 9 Рідина хроматографія Методи та техніка

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я РОСІЙСЬКОЇ ФЕДЕРАЦІЇ ФАРМАКОПЕЙНА СТАТТЯ Індапамід ФС.2.1.0017.15 Індапамід Indapamidum Натомість ФС 42-0303-08 N-[(2RS)-2-3-2 -4-хлорбензамід

АМІНОКИСЛОТИ. Пептид. БІЛКИ Амінокислотами називаються карбонові кислоти, у вуглеводневому радикалі яких один або кілька атомів водню заміщені аміногрупами. Залежно від взаємного розташування

БІОХІМІЯ За редакцією члена-кореспондента РАН, професора О.С. СЕВЕРИНА 5-е видання, виправлене та доповнене Підручник Рекомендовано Навчально-методичним об'єднанням з медичного та фармацевтичного

1 Амінокислоти та білки Будова, властивості Спіралі зустрічаються в багатьох областях: в архітектурі, макромолекулах білків, нуклеїнових кислот і навіть у полісахаридах (Loretto hapel, Santa Fe, NM/ Sarbo)

МІНОБРНАУКИ РОСІЇ Федеральний державний автономний освітній заклад вищої освіти"НОВОСИБІРСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ ДОСЛІДНИЙ ДЕРЖАВНИЙ УНІВЕРСИТЕТ" Факультет природних

APP NOTE-16/2016LC Аналітичні можливості рідинного хроматографа МаестроВЕРХ з низькотемпературним випарним детектором світлорозсіювання МАЕСТРО ELSD на прикладі визначення амінокислот у гідролізаті

8. Запитання 1. Дайте визначення хроматографії. 2. Які особливості хроматографії дозволяють досягти кращого розподілу речовин з близькими властивостями в порівнянні з іншими методами розподілу. 3. Перерахуйте

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ РФ ФЕДЕРАЛЬНА ДЕРЖАВНА БЮДЖЕТНА ОСВІТАЛЬНА УСТАНОВА ВИЩОЇ ПРОФЕСІЙНОЇ ОСВІТИ «НИЖЕГОРОДСЬКИЙ ГОСУД.

1 Особливості будови, реакційної спроможності та методи синтезу амінокислот. Білки Сполука, яка містить одночасно і кислотну функціональну групу, і аміногрупу, є амінокислотою. Кислотно-основні

Переваги колонок Agilent AdvanceBio SEC для екслюзійної хроматографії при аналізі біофармацевтичних препаратів Порівняння колонок різних виробників для підвищення якості даних Огляд технічної

«Заводська лабораторія. Діагностика матеріалів» 4. 2007. Том 73 23 УДК 543.544 ВИЗНАЧЕННЯ АМІНОКИСЛОТ У ЛІКАРСЬКИХ ПРЕПАРАТАХ МЕТОДОМ ЗВОРОЧЕНО-ФАЗОВИЙ ВЕРХ З АМПЕРОМЕТРИЧНИМ ДІТЕЙ.

УДК 615.22.074: 543.544.5.068.7.062 ВАЛІДАЦІЯ МЕТОДИК КІЛЬКІСНОГО ВИЗНАЧЕННЯ ТРИМЕТАЗИДИНУ ДИГИДРОХЛОРИДА В ТАБЛЕТКАХ ПО, 0,02 М. Ц.

СУЧАСНА ПРЕПАРАТИВНА ФЛЕШ-ХРОМАТОГРАФІЯ Частина 2* А.Аболін, к.х.н., "ГалаХім" [email protected]П.-Ф. Ікар, Interchim (Франція) Ми продовжуємо публікувати матеріали про сучасні методи препаративної

Додаток до свідоцтва 44071 лист 1 про затвердження типу засобів вимірювань ОПИС ТИПУ ЗАСОБИ ВИМІРЮВАНЬ Хроматографи високоефективні рідинні «Міліхром А-02», «Альфахром А-02» («Alphachrom A-02»)

ДЕРЖСТАНДАРТ РОСІЇ СХІДНО-СИБІРСЬКИЙ НАУКОВО-ДОСЛІДНИЙ ІНСТИТУТ ФІЗИКО-ТЕХНІЧНИХ ТА РАДІОТЕХНІЧНИХ ВИМІРІВ СВІДЧЕННЯ про атестацію МВІ 02-20

РОЗДІЛ 1 ВИЗНАЧЕННЯ ЕВОЛЮЦІЙНИХ ДИСТАНЦІЙ І ШВИДКОСТЕЙ ЕВОЛЮЦІЇ АМІНОКИСЛОТНИХ НАСЛІДКІВ 1.1. ТЕОРЕТИЧНІ ОСНОВИ Еволюційна дистанція між амінокислотними послідовностями (p, d) середня

01/2016:20255 2.2.55. ПЕПТИДНЕ КАРТУВАННЯ Пептидне картування є методом ідентифікації білків, особливо одержуваних методом рекомбінантних ДНК. Метод включає хімічне або ферментативне

Міністерство освіти та науки Російської ФедераціїФЕДЕРАЛЬНИЙ ДЕРЖАВНИЙ БЮДЖЕТНИЙ ОСВІТНИЙ ЗАКЛАД ВИЩОЇ ОСВІТИ «САРАТІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ ДОСЛІДНИЙ ДЕРЖАВНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

Конформація білків: принципи формування 1. Зв'язки, що визначають конформацію білкових молекул ковалентні зв'язки: пептидна дисульфідна нековалентна взаємодія: іонні взаємодії

ФЕДЕРАЛЬНА АГЕНЦІЯ З ОСВІТИ Державна освітня установа вищої професійної освіти «Уральський державний університет ім. А.М. Горького» ІОНЦ «Екологія та природокористування»

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я РОСІЙСЬКОЇ ФЕДЕРАЦІЇ ФАРМАКОПЕЙНА СТАТТЯ Кеторолаку трометамол ФС.2.1.0022.15 Кеторолаку трометамол Ketorolacum trometamolum Натомість ГФ XII, 2-2-2-2-2-2-2-2 -карбоксилат

Московський фізико-технічний інститут (Державний університет) Департамент молекулярної та біологічної фізики Фізичні методи дослідження Лекція 8 Детектори у хроматографії Рідина хроматографія

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я РОСІЙСЬКОЇ ФЕДЕРАЦІЇ ФАРМАКОПЕЙНА СТАТТЯ Мелоксикам ФС.2.1.0025.15 Мелоксикам Meloxicamum Замість ГФ XII, ч. 1, ФС 42-0254-0-5--2- іл)-1,1-діоксо-1λ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК БІЛОРУСІ РУП «НАУКОВО-ПРАКТИЧНИЙ ЦЕНТР НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК БІЛОРУСІ ЗА ПРОДОВОЛЕННЯМ»

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ Актуальність роботи В даний час метод високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) широко застосовується для ідентифікації та визначення вмісту складних органічних

Валідація аналітичних методів: практичне застосування. Писарєв В.В., к.х.н., МВА, заступник генерального директора ФГУП "Державний науковий центр з антибіотиків", Москва (www.pisarev.ru)

2.2.29. ВИСОКОЕФЕКТИВНА РІДИНА ХРОМАТОГРАФІЯ Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) являє собою метод поділу, заснований на різному розподілі речовин між двома такими, що не змішуються.

МІНОБРНАУКИ РОСІЇ НАЦІОНАЛЬНИЙ ДОСЛІДНИЙ ТОМСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХІМІЧНИЙ ФАКУЛЬТЕТ Анотована робоча програма дисципліни Хроматографічні методи аналізу

Використання продуктів Agilent Bond Elut Plexa для зниження іонної супресії та покращення чутливості рідинної хроматомас-спектрометрії (ЖХ-МС) Методичні рекомендації Фармацевтичні засоби

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я РОСІЙСЬКОЇ ФЕДЕРАЦІЇ ФАРМАКОПЕЙНА СТАТТЯ Карбамазепін ФС.2.1.0020.15 Карбамазепін Натомість ФС 42-2803-96; Carbamazepinum замість ДФ XII, ч.1, ФС 42-0240-07 5H-Дібензазепін-5-карбоксамід

Лекція 22. Амінокислоти. Білки Робота найкращий спосіб насолоджуватися життям. І. Кант. Номенклатура амінокислот. Природні амінокислоти. Хіральність амінокислот, що утворюють протеїни. Кислотноосновні властивості,

APP NOTE-10/2016LC Аналітичні можливості рідинного хроматографа МаестроВЕРХ з детектором на діодній матриці та детектором фотометричним з фіксованими довжинами хвиль (світлодіодний) на прикладі визначення

Хімія Лекція 3 α-амінокислоти, пептиди, білки. Лекцію читає проф. Бєлавін Іван Юрійович 2. α-амінокислоти, пептиди, білки α-амінокислоти білки біорегулятори джерело енергії α-амінокислоти гетерофункціональні

Лабораторна робота 11. МЕХАНІЗМИ ОСНОВНИХ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНИХ ПРОЦЕСІВ Мета заняття: ознайомитися зі складом ДНК та РНК, процесами реплікації, транскрипції та трансляції на прикладі рішення типових

APP NOTE-34/2018LC Аналітичні можливості рідинного хроматографа Маестро ВЕРХ з детектором на діодній матриці на прикладі визначення вмісту фенольних та фуранових сполук у коньяках згідно

Тестування комбінованих лікарських засобів з фіксованим дозуванням на вміст домішок за допомогою рішення для аналізу домішок системи Agilent 129 Infinity II HDR-DAD Impurity Analyzer

APP NOTE-18/2017LC Аналітичні можливості рідинного хроматографа МаестроВЕРХ з амперометрічним детектором на прикладі визначення катехоламінів у плазмі крові Яшин А. Я. к. х. н., провідний інженер

ГОСТ Р 51435-99 Сік яблучний, сік яблучний концентрований та напої, що містять яблучний сік. Метод визначення вмісту патуліна за допомогою високоефективної рідинної хроматографії. ГКС 67.160.20

ВІДГУК ОФІЦІЙНОГО ОПОНЕНТА про дисертацію Шашкова Михайла Вадимовича «Дослідження високополярних нерухомих рідких фаз на основі іонних рідин для капілярної газової хроматографії» на здобуття

ПЕПТИДИ, природні або синтетичні. соед., молекули яких брало побудовані з залишків a -амінокислот, з'єднаних між собою пептидними (амідними) зв'язками C(O) NH. Можуть утримувати в молекулі також неамінокислотну компоненту (наприклад, залишок вуглеводу). За кількістю амінокислотних залишків, що входять у молекули пептидів, розрізняють діпепетиди, трипептиди, тетрапептиди і т.д. Пептиди, що містять до 10 амінокислотних залишків, зв. олігопептидами, що містять більше 10 амінокислотних залишків поліпепти-дами Прир поліпептиди з мол. м. понад 6 тис. зв. білками

Історична довідка.Вперше пептиди були виділені із ферментативних гідролізатів білків. Термін "пептиди" запропонований Е. Фішером. Перший синтетичний пептид отримав T. Курціус в 1881 Е. Фішер до 1905 р. розробив перший загальний методсинтезу пептидів та синтезував ряд олігопептидів разл. будови. Істот. Внесок у розвиток хімії пептидів внесли учні Е. Фішера Е. Абдергальден, Г. Лейке та М. Бергман. У 1932 р. Бергман і Л. Зервас використовували в синтезі пептидів бензилоксикарбонільну групу (карбобензоксигрупу) для захисту a-аміногруп амінокислот, що ознаменувало новий етап у розвитку синтезу пептидів. Отримані N-захищені амінокислоти (N-карбобензоксиамінокислоти) широко використовували для отримання різних пептидів, які успішно застосовували для вивчення низки ключових проблем хімії і біохімії цих B-B, напр, для дослідження субстратної специфічності протеолитич. ферментів. Із застосуванням N-карбобензоксиамінокислот були вперше синтезовані природні пептиди (глутатіон, карнозин та ін.). Важливе досягнення у цій галузі розроблений на поч. 50-х рр. P. Воганом та ін. синтез пептидів методом змішаних ангідридів (докладно методи синтезу пептидів розглянуті нижче). У 1953 В. Дю Виньо синтезував перший пептидний гормон-окситоцин. На основі розробленої P. Мерріфілдом в 1963 концепції твердофазного пептидного синтезу були створені автоматичні. синтезатори пептидів Набули інтенсивного розвитку методи контрольованого ферментативного синтезу пептидів. Використання нових методів дозволило здійснити синтез гормону інсуліну та ін.

Успіхи синтетич. хімії пептидів були підготовлені досягненнями в галузі розробки таких методів поділу, очищення та аналізу пептидів, як іонообмінна хроматографія, електрофорез на разл. носіях, гель-фільтрація, високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ), імуно-хім. аналіз та ін. Отримали великий розвиток також методи аналізу кінцевих груп та методи ступінчастого розщеплення пептидів. Були, зокрема, створені автоматичні. амінокислотні аналізатори та автоматич. прилади визначення первинної структури пептидов-т.наз. секвенатори.

Номенклатура пептидів.Амінокислотний залишок пептидів, що несе своб. a-аміногрупу, зв. N-кінцевим, а несучий своб. a-карбоксильну групу - С-кінцевим. Назва пептиду образується із назв. амінокислотних залишків, що входять до його складу, перераховуються послідовно, починаючи з N-кінцевого. При цьому використовують тривіальні назви. амінокислот, в яких брало закінчення "ін" замінюється на "мул"; виняток C-кінцевий залишок, назв. якого збігається з назв. відповідної амінокислоти. Всі амінокислотні залишки, що входять до пептидів, нумеруються, починаючи з N-кінця. Для запису первинної структури пептидів (амінокислотної послідовності) широко використовують трибуквенні та однобуквенні позначення амінокислотних залишків (напр., Ala Ser-Asp Phe-GIy аланіл-серил-аспарагіл-фенілаланіл-глі-цин).

Будова.Пептидна зв'язок має св-ва частково подвійного зв'язку. Це проявляється у зменшенні довжини зв'язку (0,132 нм) порівняно з довжиною простого зв'язку C N (0,147 нм). Частково двозв'язний характер пептидного зв'язку унеможливлює своб. обертання заступників довкола неї. тому пептидне угруповання є плоским і має зазвичай транс-конфігурацію (ф-ла I). T. обр., остов пептидного ланцюга є ряд жорстких площин з рухомим ("шарнірним") зчленуванням у місці, де розташовані асиметрич. атоми З (у ф-лі I позначені зірочкою).

У розчинах пептидів спостерігається переважне утворення певних конформерів. З подовженням ланцюга більш виражену стійкість набувають (аналогічно білкам) упорядковані елементи вторинної структури (a-спіраль та b-струк-тура). Утворення вторинної структури особливо притаманно регулярних пептидів, зокрема поліамінокислот.

Властивості. Олігопептиди по св-вам близькі до амінокислот, поліпептиди подібні до білків. Олігопептиди є, як правило, кристалліч. в-ва, що розкладаються при нагр. до 200 300 0 C. Вони добре розтв. у воді, розб. к-тах і лугах, майже не розтв. в орг. р-телегля. Виняток Олігопептиди, побудовані із залишків гідрофобних амінокислот.

Олігопептиди мають амфотерні св-вами і, залежно від кислотності середовища, можуть існувати у формі катіонів, аніонів або цвіттер-іонів. Осн. смуги поглинання в ІЧ спектрі для групи NH 3300 і 3080 см -1 для групи C = O 1660 см -1 . В УФ діапазоні смуга поглинання пептидної групи знаходиться в області 180-230 нм. Ізоелектрич. точка (рI) пептидів коливається у межах і залежить від складу амінокислотних залишків у молекулі . Величини рК а пептидів становлять для а-СООН бл. 3 для a -N H 2 ок. 8.

Хім. св-ва олигопептидов визначаються які у них функц. групами, а також особливостями пептидного зв'язку. Їхній хімічний. перетворення на значить. мірою аналогічні відповідним р-ціям амінокислот. Вони пропонують покласти. біуретову реакцію та нінгідринову реакцію. Дипептиди та їх похідні (особливо ефіри) легко циклізуються, перетворюючись на дикетопіперазини. Під дією 5,7 зв.

соляної к-ти пептиди гідролізуються до амінокислот протягом 24год. при 105 0 C.

Синтез.Хім. синтез пептидів полягає у створенні пептидного зв'язку між групою COOH однієї амінокислоти та NH 2 ін. амінокислоти або пептиду. Відповідно до цього розрізняють карбоксильну та амінну компоненти р-ції пептидного синтезу. Для проведення цілеспрямованого контрольованого синтезу пептидів необхідна попередня. тимчасова захист всіх (або деяких) функцій. груп, які не беруть участь в утворенні пептидного зв'язку, а також попереджає. активація одного з компонентів пептидного синтезу. Після закінчення синтезу захисні групи видаляють. При отриманні біологічно активних пептидів необхідна умова - запобігання рацемізації амінокислот усім етапах пептидного синтезу.

наиб. важливі способи утворення пептидного зв'язку при здійсненні р-ції р-ре-методи активир. ефірів, кар-бодіімідний, змішаних ангідридів та азидний метод.

Метод активованих ефірів ґрунтується на попередньому. утворенні складноефірного похідного карбоксильної компоненти шляхом введення в неї спиртового залишку, що містить сильний електроноакцепторний замісник. В результаті утворюється високореакційноспо-собний ефір, що легко піддається амінолізу під дією амінокомпоненти пептидного синтезу. Як активір. ефірів при синтезі пептидів широко використовують пента-фтор-, пентахлор-, трихлор-і n-нітрофенілові та ряд ін. ефірів захищених амінокислот і пептидів.

Карбодіімідний метод утворення пептидного зв'язку передбачає використання як конденсуючих реагентів разл. заміщених карбодіімідів. Особливо широке застосування при синтезі пептидів отримав дициклогексил-карбодімід:

X та Y-соотв. N- і С-захисні групи З цим конденсуючим реагентом можна здійснювати синтез пептидів і у водних середовищах, т. К. Швидкості р-цій гідролізу і амінолізу проміжної О-ацилізомо-чевини (II) істотно різняться. При синтезі пептидів знаходять також застосування разл. водорозчинні карбодіімі-ди (напр., N-диметиламінопропіл-N"-етилкарбодімід).

Метод змішаних ангідридів заснований на попередньому. активації карбоксильної компоненти пептидного синтезу шляхом утворення змішаного ангідриду з карбоновою або неорг. до того. наиб. часто використовують алкілові ефіри хлормурашиної (хлорвугільної) к-ти, особливо етиловий та ізобутиловий ефіри, напр.:

В - третинний амін

При синтезі пептидів за цим методом дуже ефективні змішані ангідриди N-ациламінокислот та півалінової (триметилоцтової) к-ти. Завдяки сильному покладе. індуктивному ефекту трет-бутил'ної групи електро-фільність карбоксильного атома С у залишку півалінової к-ти істотно знижена, і це, поряд зі стерич. перешкодами, що пригнічує небажат. побічну р-цію освіти уретана та своб. N-ациламінокислоти, к-раю здійснюється за схемою:

В одному з варіантів методу змішаних ангідридів застосовують як конденсуючий агент 1-этоксикар-бонил-2-этокси-1,2-дигидрохинолин. Це єднання. легко утворює з карбоксильною компонентою пептидного синтезу проміж. змішаний ангідрид, що швидко вступає в р-цію конденсації, причому повністю виключається небажають. побічна р-ція.

Окремий випадок способу змішаних ангідридів - спосіб симетрич. ангідридів, в якому використовують ангідриди амінокислот 2 O. Їх застосування виключає можливість диспропорціонування або неправильного амінолізу.

Азидний метод синтезу передбачає активацію карбоксильної компоненти, перетворенням її на азид N-заміщеної амінокислоти або пептиду:

Зважаючи на нестійкість азидів їх у своб. вигляді з розчину, як правило, не виділяють. Якщо замість нітритів лужних металів для р-ції з гідразидом використовувати алкілові ефіри азотистої к-ти (напр., трет-бутилнітрит), то азидну конденсацію можна проводити в орг. р-рітелі; утворюється HN 3 пов'язують третинними амінами. Нерідко азидна конденсація ускладнюється небажано. побічними р-ціями (перетвор. гідразиду над азид , а амід; р-циягідразиду з азидом, що веде до утворення 1,2-діацил-гідразину; проміж. утворення ізоціанату, який в результаті перегрупування Курціуса може призводити до похідного сечовини або відповідного уретана та ін.). Переваги азидного методу - мала ступінь рацемізації, можливість застосування серину та треоніну без захисту гідроксильних груп.

Для перетвор. захищених пептидів у вільні використовують спец. методи деблокування, які засновані на р-ціях, що забезпечують відщеплення разл. захисних груп, що гарантують збереження всіх пептидних зв'язків у молекулі. Приклади деблокування: видалення бензил оксикарбонільної групи каталітич. гідрогеноліз при атм. тиску та кімнатній т-рі, відщеплення трет-бутилоксикарбонільної групи м'яким ацидолізом, а також гідролітіч. відщеплення трифторацетильної групи під впливом розб. р-рів основ .

При синтезі біологічно активних пептидів важливо, щоб не відбувалася рацемізація, яка може здійснюватися в результаті оборотного відщеплення H + від a -атома С N-ациламінокислоти або пептиду. Рацемізації сприяють підстави і к-ти, висока т-рата полярні р-телі. Вирішальну роль грає рацемізація, що каталізується підставами, яка може протікати по т. зв. азлактонового механізму або через енолізацію за схемою:

наиб. важливі способи виключення рацемізації: 1) нарощування пептидного ланцюга у напрямку від С-кінця до N-кінцяіз застосуванням N-захисних груп типу ROC(O). 2) Активація N-захищених пептидних фрагментів з С-кінцевими залишками проліну або гліцину. 3) Використання азидного методу (за відсутності надлишку третинної основи і підтримці низьких т-р в реакц. Середовищі). 4) Застосування актив. ефірів амінокислот, аміноліз яких протікає через перехідний стан, стабілізір. водневими містками (напр., ефірів, утворених з N-гідроксипіпери-діном та 8-гідроксихіноліном). 5) Використання карбоді-імідного методу з добавками N-гідроксоїд. або к-т Льюїса.

Поряд із синтезом пептидів у розчинах, важливе значення має синтез пептидів із застосуванням нерозчинних носіїв. Він включає твердофазний синтез пептидів (р-ція, або метод, Мер-ріфілд) і синтез пептидів з використанням полімерних реагентів.

Стратегія твердофазного пептидного синтезу передбачає тимчасове закріплення пептидного ланцюга, що синтезується, на нерозчинному полімерному носії і здійснюється за схемою:

Завдяки цьому способу вдалося замінити дуже складні та трудомісткі процедури поділу та очищення проміж. пептидів простими операціями промивання і фільтрування, а також звести процес пептидного синтезу до стандартної послідовності процедур, що періодично повторюються, легко піддаються автоматизації. Метод Мерріфілда дозволив суттєво прискорити процес синтезу пептидів. На основі цієї методології створено разл. типи автоматич. синтезаторів пептидів

З'єднання високо виробляє. Твердофазного синтезу пептидів з роздільними здібностями препаративної ВЕРХ забезпечує вихід на якісно новий рівень хім. синтезу пептидів, що, своєю чергою, благотворно впливає розвиток разл. областей біохімії, мовляв. біології, генної інженерії, біотехнології, фармакології та медицини.

Стратегія синтезу пептидів із застосуванням полімерних реагентів передбачає тимчасове зв'язування з високомолою. носієм актив. карбоксильні компоненти або конденсуючого агента пептидного синтезу. Перевага цього методу: закріплені на полімері реагенти можуть вводитися надлишку, а відділення синтезованих пептидів від нерозчинних полімерів не становить труднощів.

Приклад такого синтезу-пропускання амінокомпоненти в заданій послідовності через дек. колонок, в кожній з яких брало знаходиться пов'язаний з полімерним

на правах рукопису

МЕЛЬНИКІВ Ігор Олегович

РОЗРОБКА МІКРОМЕТОДІВ АНАЛІЗУ АМІНОКИСЛОТ,

КОРОТКИХ ПЕПТИДІВ І ОЛІГОНУКЛЕОТИДІВ

З ВИКОРИСТАННЯМ ОФ ВЕРХ І КАПІЛЯРНОГО

ЕЛЕКТРОФОРЄЗА

Спеціальність: 02.00.02 – Аналітична хімія

Дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук

МОСКВА 2006 Дисертаційну роботу виконано на кафедрі аналітичної хімії Московської державної академії тонкої хімічної технології ім.

М.В. Ломоносова та у групі аналітичної хімії білка інституту біоорганічної хімії ім. академіків М.М. Шемякіна та Ю.А. Овчиннікова РАН.

Науковий керівник:

кандидат хімічних наук, доцент Глубоков Юрій Михайлович

Офіційні опоненти:

доктор хімічних наук, професор Макаров Микола Васильович кандидат хімічних наук Кириллова Юлія Геннадіївна

Провідна організація:

Інститут біо хімічної фізикиім. Н.М. Емануеля РАН

Захист відбудеться 20 грудня 2006 року о 12 00 на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 212.120.05 при Московській державній академії тонкої хімічної технології ім. М.В. Ломоносова за адресою: 119571, Москва, проспект Вернадського, д. 86, ауд. М-119.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Московської державної академії тонкої хімічної технології ім. М.В. Ломоносова.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат хімічних наук Ю.А. Єфімова Актуальністьроботи. Нині клінічні дослідження дедалі більше орієнтуються використання інструментальних мікрометодів аналізу для діагностики найпоширеніших і найнебезпечніших соціальнозначимих захворювань. Значна частина цих методів не повністю і не завжди забезпечує своєчасне та якісне їхнє діагностування, що часто не відповідає сучасним вимогам моніторингу біохімічного статусу людини.

Вільні амінокислоти та короткі пептиди, що входять до складу фізіологічних рідин, мають важливе функціональне значення. У ряді випадків вони можуть виступати у ролі молекулярних маркерів певних захворювань.

Зміна їхньої концентрації часто пов'язана з метаболічними порушеннями, які свідчать про розвиток того чи іншого захворювання. Більшість існуючих методів амінокислотного аналізу є або недостатньо чутливими та селективними для їх ідентифікації, або вимагають дериватизації амінокислот, що суттєво ускладнює процес їх визначення. Проблема простого та економічного аналізу вільних генетично кодованих амінокислот досі до кінця не вирішена. У той же час клінічний аналіз амінокислот потребує їх перед- або постколонкової модифікації для високочутливого та селективного визначення. Зміна вмісту молекулярних маркерів у фізіологічних рідинах може бути пов'язане також із генетичною схильністю пацієнта до конкретного захворювання. Звідси випливає необхідність проведення порівняльного аналізу фрагментів ДНК з метою підвищення достовірності визначення причин досліджуваного захворювання та ефективнішої його терапії.

Тим часом необхідна для амінокислотного та нуклеотидного аналізу апаратура імпортного виробництва, як правило, є дорогою та малодоступною для більшості клінічних лабораторій. Ситуація посилюється ще й тим, що багато приладів є вузькоспеціалізованими для кожного виду захворювання, внаслідок чого спостерігається множинне дублювання діагностичних методів як по апаратурі, так і методології.

Це різко підвищує вартість клінічних досліджень і ускладнює порівняння. Автор висловлює подяку керівнику групи аналітичної хімії білка ІХХ РАН ст.н.с., к.х.н. І.В. Назимову за постійну допомогу, увагу та обговорення результатів.

ня отриманих результатів аналізу. Таким чином, розробка нових методик, що розширюють можливості використання загальнодоступного аналітичного обладнання вітчизняного виробництва для високочутливого експресного та надійного визначення вільних та модифікованих амінокислот, коротких пептидів та олігонуклеотидів як для структурного аналізу біополімерів та їх фрагментів, так і в клініко-діагностичних цілях є актуальною науковою. .

Мета роботи. Метоюдисертаційною роботою є розробка комплексу інструментальних високочутливих мікрометодів аналізу вільних та модифікованих амінокислот, коротких пептидів та олігонуклеотидів з використанням вітчизняної інструментальної бази.

Наукова новизна.

1. Розроблено методики визначення не модифікованих генетично кодованих -амінокислот з використанням методів капілярного зонального електрофорезу та міцелярної електрокінетичної хроматографії з прямим УФ-фотометричним та рефрактометричним способами детектування.

2. Розроблено та застосовано в клінічній практиці методики спільного визначення низькомолекулярних амінотіолів у плазмі крові з використанням методів обернено-фазової високоефективної рідинної хроматографії та капілярного зонального електрофорезу з флуориметричним та прямим УФ-фотометричним способами детектування.

3. Розроблено методику визначення фрагментів мутантного гена венозних тромбозів на основі аналізу продуктів аллель-специфічної полімеразної ланцюгової реакції методом капілярного гель-електрофорезу з флуориметричним детектуванням.

Практична значимість . Розроблений метод амінокислотного аналізу дозволяє визначати мікрокількості амінокислот, що генетично кодуються, без їх попередньої дериватизації, що істотно спрощує існуючу схему аналізу. Розроблено та запропоновано для практичного використання комплекс методів аналізу молекулярних маркерів судинних катастроф (гомоцистеїн, цистеїн, глутатіон), а також фрагментів мутантного гена венозних тромбозів. В результаті проведеної роботи вдалося показати можливість ефективного використання вітчизняної апаратури для проведення біохімічного аналізу як білкових, так і нуклеїнових компонентів на тому самому приладі для капілярного електрофорезу. Визначення сірковмісних амінокислот і пептидів у плазмі за розробленою в даній роботі методикою використовували для оцінки фактора ризику десятків пацієнтів з достовірно встановленим інфарктним та передінфарктним станом. Результати проведеної роботи використані під час створення та апробування на практиці біомедичного аналізу універсального економічного автоматизованого комплексу приладів та методів молекулярної діагностики деяких соціально-значущих захворювань (інфаркти, інсульти, тромбози), що розробляється в інституті аналітичного приладобудування РАН.

На захист виносяться:

способи визначення генетично кодованих амінокислот у водному розчині без їх попередньої дериватизації з використанням капілярного зонального електрофорезу та міцелярної електрокінетичної хроматографії;

оптимізовані умови дериватизації низькомолекулярних амінотіолів плазми з використанням флуорогенних реагентів (монобромобіман та 5-іодоацетамідофлуоресцеїн);

методика аналізу низькомолекулярних амінотіолів плазми крові з використанням ОФ ВЕРХ та капілярного електрофорезу;

результати визначення вмісту гомоцистеїну в плазмі крові методами ОФ ВЕРХ та капілярного зонального електрофорезу;

спосіб визначення мутантного гена венозних тромбозів з використанням капілярного гель-електрофорезу в лінійному полі-N,N`диметилакриламіді.

Апробація роботи. Основні результатироботи були представлені на 8м Всеросійському симпозіумі з молекулярної рідинної хроматографії та капілярного електрофорезу (15-19 жовтня 2001 р. Москва, Росія), 3-му Міжнародному симпозіумі за методами поділу в біонауках (13-18 травня 2003 р., Москва, Росія, ), Міжнародній конференції студентів та аспірантів з фундаментальних наук «Ломоносів-2005» (Секція хімія. 12-15 квітня 2005 р., Москва, Росія), 2-ій науково-практичній конференції «Актуальні проблеми медичної біотехнології» (12-14 вересня 2005, Анапа, Росія), 3-му з'їзді товариства біотехнологів Росії ім. Ю.А. Овчиннікова (25-27 жовтня 2005 р., Москва, Росія), 1-ої конференції молодих учених МІТХТ ім. М.В. Ломоносова (13-14 жовтня 2005 р., Москва, Росія), Міжнародному конгресі з аналітичних наук ICAS-2006 (25-30 червня 2006 р., Москва, Росія), 31-му Міжнародному конгресі федерації європейських біохімічних товариств (24-29 червня р., Стамбул, Туреччина), 26-му Міжнародному симпозіумі з поділу білків, пептидів та полінуклеотидів (16-20 жовтня 2006 р., Інсбрук, Австрія).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 12 робіт у вигляді статей та тез доповідей.

Структура дисертації. Дисертація складається із вступу, літературного огляду, експериментальної частини, обговорення результатів, висновків та списку цитованої літератури.

Матеріал дисертації викладено на 147 сторінках, містить 19 таблиць та 42 малюнки. Список літературних джерел складається із 187 найменувань.

У вступідано обґрунтування теми, сформульовані цілі дослідження та положення, що виносяться на захист, відзначено його наукову новизна та практичну значимість. Наведено дані про апробацію та публікацію результатів дослідження, а також про структуру та обсяг дисертації.

1-ий розділ. Наведено загальні відомості про існуючі методи аналізу досліджуваних сполук. Докладніше описані хроматографічні методи та ряд загальноприйнятих способів ідентифікації. Розглянуто методи визначення низькомолекулярних амінотіолів плазми, а також фрагментів ДНК. Проведено порівняння існуючих методик аналізу амінокислот, коротких пептидів та олігонуклеотидів та обґрунтовано актуальність проведення подальших досліджень у цій галузі.

Другий розділ. Наведено дані про матеріали, реагенти, способи приготування використовуваних розчинів та виконання роботи.

3-й розділ. Результати та обговорення.

Зміст вільних амінокислот (АК) у фізіологічних рідинах є діагностичним параметром низки захворювань. Виконане дослідження спрямоване на розробку методики, що дозволяє швидко та надійно їх розділяти та ідентифікувати. Аналіз сумішей таких АК проводили, використовуючи капілярний зональний електрофорез (КЗЕ) і міцелярну електрокінетичну хроматографію.

А) Буфер: 60 мМ борат натрію, рН 11,0. Напруга: 20 кВ. Сила струму: 93 мкА. Температура: 21,0 оС оптимального складу фонового електрочасу введення проби: 7,0 с (електрокінетично, напруга при введенні проби – 5 кВ). Введені троліти. Для цього було проведено скриколіки АК – 0,1 нг; аланін, тирозин - 0,2 нг.

4 – Пролін; 5 - Аланін; 6 – Тирозин; 7 – Серін; - Аспарагінова к-та; 9 - Метіонін.

CAPS буферних систем, а також їх різних поєднань на прикладі модельної суміші з 8 АК з різними за природою і властивостями радикалами і значеннями рКа аміногрупи, що максимально розрізняються. Приклад поділу такої суміші з використанням фонового боратного електроліту наведено на рис.1.

Оптимальним фоновим електролітом для поділу вільних АК даним методом є розчин, що містить 60 мМ буфера боратного (рН 11,0).

З його використанням було вивчено вплив різних факторів(Напруга, сила струму, внутрішній діаметр і ефективна довжина капіляра, спосіб введення проби) на ефективність поділу і показано, що в умовах експерименту не вдається провести повне поділ суміші всіх АК, що кодуються. З експерименту випливає, що прийнятно поділяються на АК, для яких різниця в часі міграції перевищує 1 хв. З цієї причини методом класичного КЗЕ не можуть бути розділені та ідентифіковані при спільній присутності гліцин, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, гістидин, фенілаланін та тирозин, а також аспарагінова, глутамінова кислоти та цистеїн. Коефіцієнт селективності їм дуже низький і близький до 1. Легко виділяються і ідентифікуються аргінін, лізин, пролін, серин, аспарагинова кислота і метионин, тобто. АК, що мають час міграції 5,5-10,0, 15 та 19,5-20,8 хв. Коефіцієнт селективності цієї групи АК має значення інтервалі 1,1 – 1,3. При використанні фосфатного фонового електроліту (рН 11,4) спостерігалася аналогічна загальна картина поділу, але з найгіршим дозволом піків. Виконані дослідження показують, що класичний КЗЕ з рефрактометричним закінченням дозволяє в кращому разі провести повний поділ та ідентифікацію у водному розчині не більше ніж 8 АК. При цьому вміст індивідуальних АК із зазначених нерозділених у такій суміші не повинен перевищувати двох.

Ефективність поділу АК помітно покращується при додаванні метанолу до фонових електролітів з рН 7. При використанні як фоновий електроліт 150 мМ фосфатного буфера (рН 2.0) з добавкою 30%об. метанолу вдалося розділити 16 із 20-ти генетично кодованих АК (рис. 2). На жаль, для повного розділення цієї суміші потрібен значний час.

Капіляр: внутрішній діаметр 75 мкм, повна довжина – 65 см, ефективна довжина – 50 см.

Температура: 28,0 оС. Час введення проби: 1,5 с (вакуум).

Ідентифікація: 1 – лізин, 2 – аргінін, 3-гістидин, 4 – гліцин, 5 – аланін, 6 –валін, 7 – ізолейцин, 8 – лейцин, 9 – серин, 10 – треонін, 11 – метіонін, 12 – фенілаланін, 13 – глутамінова кислота, 14 – пролін, 15 – аспарагінова кислота, 16 – тирозин.

Оскільки застосований класичний КЗЕ при рН 7 не забезпечив необхідної якості поділу, було вирішено застосувати для аналізу вільних АК метод МЕКХ з прямим УФ детектуванням. Як детергент у буферні розчини додавали додецилсульфат натрію (ДДСН). У процесі роботи застосовували різноманітні концентрації компонентів фонового електроліту. Найкращі результати були отримані при використанні фонового електроліту, що містить 133 мМ борної кислоти, 33 мМ натрію борату і 100 мМ ДДСН, рН 9,5. Використання електроліту зазначеного складу істотно збільшило кількість аналізованих АК при одночасному визначенні при значеннях рН фонового електроліту, що лежать в основній області. На рис. 3 наведена електрофореграма суміші 14 АК.

Рис. 3. Поділ суміші 14 вільних АК методом міцелярної електрокінетичної хроматографії з прямим УФ-детектуванням. Капіляр: внутрішній діаметр 50 мкм, повна довжина 122 см, ефективна довжина 35 см. Буфер:

133 mM борна кислота, 33 mM тетраборат натрію (pH 9.5) 100 mM додецилсульфат натрію. Напруга: 20 кВ. Сила струму: 48 мкА. Температура: 27,5 oC. Час введення проби: 3,0 с (вакуум).

Введені кількості АК – 5,0 нг. Аланін, валін, ізолейцин та гліцин – 7,0 нг.

Ідентифікація: 1 – Валін, 2 – Аланін, 3 – Ізолейцин, 4 – Гліцин, 5 – Серін, 6 – Треонін, 7 – Тирозин, 8 – Гістидин, 9 – Фенілаланін, 10 – Аргінін, 11 – Лізін, 12 – Цистеїн, 13 - Метіонін, 14 - Глутамінова кислота. * - Системні піки.

Привертають увагу отримані значення часів міграції.

Незважаючи на меншу ефективну довжину капіляра вони зазвичай вище, ніж у випадку класичного КЗЕ, що досить добре узгоджується з природою МЕКХ. Це також може бути пов'язане з величиною напруги на одиницю довжини капіляра. Необхідна для поділу АК різниця у часі міграції значно менша, ніж у випадку КЗЕ. Достатньо, щоб вона становила 0,5 хв.

Більш детально провели дослідження умов поділу 14 генетично кодованих АК, зазвичай присутніх у плазмі здорових донорів у вільному стані. Вивчали вплив рН та добавок до фонового електроліту різних органічних розчинників на ступінь дозволу піків. З експерименту слід, що з досягнення повного поділу суміші 14 АК значення рН має лежати інтервалі 9,0-10,0. При рН, що лежить поза зазначеного інтервалу, не забезпечується необхідне дозвіл АК. Вочевидь, при рН 9 це з різницею між значеннями рКа (АК), а при рН 10 - через часткового розпаду кон'югатів ДДСНАК. Вплив добавок органічних розчинників вивчали, використовуючи метанол, 2-пропанол та ацетонітрил. Отримані дані показують, що добавка будь-якого органічних розчинників призводить до істотної зміни часів міграції і коефіцієнтів селективності. Характер зміни визначається природою та концентрацією добавки. Метанол і ацетонітрил не покращують поділ вивчених АК, що, мабуть, пов'язане з їхньою малою здатністю утворювати змішані кон'югати АК-ДДСН-R, де R – молекула органічного розчинника. Добавка 3-5% 2-пропанолу істотно покращує рівень роздільної здатності компонентів, при відносно невеликому збільшенні часу міграції АК. При збільшенні концентрації 2-пропанолу спостерігається помітне зростання часів міграції АК, що призводить до зниження експресності визначення. Спеціально проведені дослідження показали, що найкращий поділ АК у присутності ефективної кількості органічного розчинника (2-пропанолу) відбувається, якщо фоновий електроліт містить 50 мМ борної кислоти, 33 мМ борату натрію та 50 мМ ДДСН. На рис. 4 наведена електрофореграма суміші 14 АК.

Наведені дані свідчать про ефективний поділ 13 з 14 АК, що генетично кодуються. Загальний час поділу не перевищує хв. Sr часу міграції складає 0,03. Дещо великі значення Sr, близькі до 0,06-0,08, спостерігається для аланіну, валіну та гістидину.

Рис. 4. Поділ суміші 14 АК методом МЕКХ із прямим УФ детектуванням Капіляр: внутрішній діаметр 75 мкм, повна довжина 61 см, ефективна довжина 41 см.

Буфер: 33 мМ тетраборат натрію, 100 мМ борної кислоти, 50 мМ ДДСН, 5% 2-пропанол, рН=10,2. Напруга: 25 кВ. Сила струму: 65 мкА. Температура: 29,5 оС. Час введення проби: 1,5 с (вакуум). Введені кількості АК – 0,5 нг.

Ідентифікація: 1-Лізин; 2 – Пролін; 3 - Фенілаланін; 4 - Аланін; 5 – Валін; 6 – глицин;

7 – гістидин; 8 – тирозин; 9 – Лейцин+Ізолейцин; 10 – Серін; 11 – Треонін; 12 - глутамінова кислота; 13 – Цистеїн.

Досягнутий рівень дозволу дозволив провести дослідження щодо кількісного визначення розглянутих АК. Було проведено аналіз модельної суміші 14 АК відомого складу. Дослідження показали, що метод МЕКХ з прямим УФ детектуванням при використанні боратного буферного розчину, що містить 3-5% 2-пропанолу, дозволяє кількісно визначати 14-16 генетично кодованих АК з похибкою (Sr) 6-8% менш ніж за 30 хв. Правильність отриманих результатів додатково проводили методом «введено-знайдено» (табл.1) Перевірка правильності визначення вмісту генетично кодованих АК методом МЕКХ (mo(АК) = 0,50 нг; введено – 1,00 нг) Аналіз гомоцистеїну та інших низькомолекулярних амінотиолів Гомоцистеїн (НСУ) і супутні йому амінотіоли (АТ) (кодована амінокислота - цистеїн (Cys), трипептид глутатіон (GSH)) у плазмі крові є молекулярними маркерами порушення функцій серцево-судинної системи. Основною метою цього дослідження була розробка методу визначення вмісту гомоцистеїну як достовірного фактора ризику таких захворювань.

Кількісний аналіз низькомолекулярних амінотіолів плазми крові включає відновлення дисульфідних зв'язків, депротеїнізацію плазми крові, модифікацію амінотіолів відповідними реагентами, поділ і ідентифікацію модифікованих амінотіолів методом ОФ ВЕРХ або КЕ з тим або. У цій роботі окислені та пов'язані з білком амінотіоли відновлювали трифенілфосфіном. Для видалення катіонів важких металів використовували добавку ЕДТА. Запропонована методика відновлення забезпечила швидке (15 хв) та повне відновлення (96%) дисульфідів та вивільнення сульфгідрильних груп при кімнатній температурі. Виходи реакцій відновлення визначали, використовуючи стандартну методику вимірювання вмісту вільних АТ. Високомолекулярні білки плазми облягали 5-сульфосаліцилової кислотою.

Її концентрація була оптимізована у процесі дослідження, що дозволило уникнути втрати чутливості через розведення на стадії нейтралізації.

Модифікацію вільних сульфгідрилів проводили монобромобіманом (mBrB) або 5-іодоацетамідо-флуоресцеїном (5-IAF). Необхідне значення рН підтримували за допомогою діетаноламіну (рК a = 8,9) та ортофосфату натрію, залежно від використовуваного модифікації АТ реагенту. Використання діетаноламіну дозволило проводити пряме контролювання утворення цільових продуктів мас-спектрометрично. Для ідентифікації похідних АТ застосовували фотометричний та флуориметричний способи детектування. Похідні характеризували методами абсорбційної, флуориметричної та мас-(MALDI-TOF, ESI) спектроскопії. Фотометричне та флуориметричне детектування проводили при довжинах хвиль, вибраних за спектрами поглинання (НСУ-МВ – 234 нм) та флуоресценції похідних НСУ (390 нм (збудження) та 478 нм (флуоресценція)). Зі спектру флуоресценції кон'югату Нсу-AF випливає, що при флуориметричному детектуванні для збудження оптимальна довжина хвилі 462 нм, а для флуоресценції - 504 нм.

Для уніфікації методик визначення та перевірки принципової можливості використання одного й того ж детектора для ідентифікації як монобіманових, так і флуоресцеїнових похідних вивчали ефективність збудження на довжині хвилі 390 нм. Інтенсивність отриманого максимуму флуоресценції, і, як наслідок, чутливість визначення була на порядок величини нижче, ніж при використанні збудження для випромінювання на довжині хвилі 462 нм.

Проаналізовано індивідуальні монобромбіманові (MB) та ацетамідофлуоресцеїнові (AF) похідні АТ, а також їх модельні суміші. Індивідуальні монобромбіманові похідні Cys, НСУ та GSH елюювалися з часом утримання (хв) 6,01±0,19, 10,76±0,17 та 11,89±0,11 відповідно (рис. 5)1.

Такий час утримування зберігається при використанні сумішей амінотіолів відомого складу. Отримані експериментальні дані дозволили розрахувати вихід реакції модифікації. Він становив не менше 97%, що добре узгоджується з відомими даними, але отриманими у жорсткіших умовах пробопідготовки. Похідні, що утворюються, були виділені з суміші і охарактеризовані мас-спектрометрично.

Флуоресцеїнові похідні Cys, НСУ та GSH елюювалися з часом утримання (хв) 8,49±0,12; 10,46±0,15 та 12,96±0,14 відповідно (рис. 6).

Хроматографічний аналіз проводився на вітчизняному високоефективному рідинному хроматографі "МіліХром А-02" (ЕкоНова, Новосибірськ) Рис. 5. ОФ ВЕРХ модельної суміші амінотіолів, модифікованих монобромобіманом. Cys-MB-50,0 мкМ, Hcy-MB-25,0 мкМ, GS-MB-25,0 мкМ.

Флуориметричне детектування (зб = 390 нм, ісп = 478 нм) Рис. 6. ОФ ВЕРХ модельної суміші амінотіолів, модифікованих 5-іодоацетамідофлуоресцеїном. Cys-AF-100,0 мкМ, Hcy-AF-150,0 мкМ, GS-AFмкМ. Флуориметричне детектування (погл = 390 нм, ісп = 478 нм) При використанні як мітки 5-IAF досягається краща роздільна здатність піків тіол-флуоресцентних кон'югатів порівняно з тіол-монобімановими кон'югатами. Вихід реакції модифікації АТ 5-IAF, визначений експериментально зменшення інтенсивності піку флуоресцентної мітки, склав 95%. Всі отримані похідні були виділені із суміші та охарактеризовані мас-спектрометрично.

Отримані дані послужили основою розробки способу кількісного визначення гомоцистеїну. Для побудови градуювальної кривої використовували зразки сумішей з вмістом від 2,5 до 100 мкМ. Вибраний інтервал включає діапазон фізіологічних концентрацій НСУ (5-50 мкМ). Як мітки використовувався mBrB. Отримана градуювальна залежність площі хроматографічного піку від вмісту гомоцистеїну в лінійній суміші у всьому вивченому концентраційному інтервалі і описується рівнянням:

Відносне стандартне відхилення результатів визначення за площею піку не перевищує 0,083, а за часом виходу – 0,026. Межа виявлення флуориметричного детектування МВ-похідних становить 1 мкМ (рис. 7).

Рис. 7. Зміна площі хроматографічного піку від концентрації НСУ Ефективність методики підтверджується порівнянням хроматограм, отриманих для індивідуальних речовин та для зразків плазми крові, підготовлених за пропонованою методикою. Виконані дослідження дозволили розробити методику кількісного визначення гомоцистеїну, цистеїну та глутатіону у плазмі крові та успішно використовувати її для рутинного аналізу вищезгаданих АТ у вигляді їх МВ-похідних (рис. 8). При розробці методики додатковий контроль проводили методом "введено-знайдено" (табл. 2).

Рис. 8. ОФ ВЕРХ плазми здорового донора. Cys-MB-192,4 мкМ, HcyMB-10,1 мкМ, GS-MB-15,7 мкМ. Флуориметричне детектування Визначення НСУ у вигляді МВ-похідних методом мікроколонкової ВЕРХ За розробленою методикою проаналізовано понад 50 зразків плазми крові здорових та хворих на серцево-судинні захворювання різного ступеня тяжкості пацієнтів. Для здорових пацієнтів середнє значення вмісту (мкМ) АТ у плазмі крові, отриманої з вени, натще, вранці становило:

для НСУ 12,75±3,21, для GSH 9,53±1,17 та для Cys 206,34±24,61. Отримані значення концентрацій потрапляють у інтервал референсних значень, які у літературі. Для пацієнтів, які страждають на серцево-судинні захворювання, знайдена концентрація Hcy в плазмі крові залежала від тяжкості захворювання. Результати корелюють із клінічним станом пацієнтів.

Досліджено можливість аналізу АТ із застосуванням такого більш дешевого та поширеного способу детектування як фотометричний. Експеримент показав, що забезпечує чутливість, яка дозволяє визначати патологічно високий вміст АТ в плазмі крові. При використанні фотометричного детектування краще використовувати як мітки 5-IAF, оскільки в цьому випадку досягається роздільна здатність піків до базової лінії (мал. 9), що дозволяє проводити кількісне визначення.

Рис. 9. ОФ ВЕРХ модельних сумішей амінотіолів, модифікованих монобромобіманом (а) та 5-іодоацетамідофлуоресцеїном (б). а) Cys-MB-50,0 мкМ, HcyMB-25,0 мкМ, GS-MB-25,0 мкМ. Б) Cys-AF-50,0 мкМ, Hcy-AF-75,0 мкМ, GS-AF-25,0 мкМ. Таким чином, виконана робота дозволила оптимізувати стадію пробопідготовки, проводити її в «м'яких умовах» з гарантованим кількісним виходом аналізованого компонента. На її основі розроблена методика, що дозволяє швидко та достовірно визначати вміст низькомолекулярних АТ у плазмі крові здорових та хворих пацієнтів. Похибка вимірів не перевищує 8,5%. Нижня межа інтервалу вимірюваних концентрацій (2,5 мкМ) свідчить про важливу можливість застосування даної методики визначення зниженого вмісту НСУ у плазмі крові. Межа виявлення описаного методу становить 1мкМ. Розроблена методика апробована на реальних зразках плазми крові пацієнтів та може бути використана для рутинного застосування.

Визначення гомоцистеїну та інших низькомолекулярних амінотіолів плазми Мал. 10. КЗЕ модельної суміші АТ, має час міграції 6,18±0,16; цистеїну модифікованих mBrB Hcy-MB-700,0 мкМ, Cys-MB-300,0 мкМ 6,83±0,20 та глутатіону – 8,54±0,17 хв, відповідно (рис. 10). Порівняно з GS-MB-700,0 мкМ. (Погл = 234 нм).

Капіляр: внутрішній діаметр 50 мкм, пів- ВЕРХ застосовуваний метод КЗЕ дозволяє довжина 82 см, ефективна довжина 62 см.

Буфер: 50 мМ тетраборат натрію рН = 11.0. скоротити час аналізу АТ на 2-3 хв.

Напруга: 25 кВ. Сила струму: 58 мкА.

(вакуум) прямим УФ-детектування недостатньо для визначення малих кількостей НСУ в плазмі крові. При вмісті гомоцистена 10 мкМ відношення сигнал/фон становить 2,5-3, а відносне стандартне відхилення лежить інтервалі 0,3-0,5. Даний метод застосовується для контролю вмісту НСУ у плазмі крові хворих з патологічно високим його вмістом (25 мкМ). Відносне стандартне відхилення при визначенні таких концентрацій становить 0,12 для MB-Cys, 0,18 для MB-Hcy і 0,17 для MB-GS.

Капілярний зональний електрофорез з флуориметричним детектуванням проводився на капілярному іонному аналізаторі «Нанофор 02» (ІАнП РАН, Санкт-Петербург) Аналіз НСУ у вигляді МВ-похідних методами ОФ ВЕРХ з флуориметричним та КЗЕ з фотометричним детектуванням (n = 5; ) Модельні суміші AF-похідних досліджували методом КЗЕ з прямим фотометричним (рис. 11) та флуориметричним (рис. 12) детектуванням (табл. 3). Фотометричне детектування проводили на довжині хвилі 492 нм, що відповідає довжині хвилі збудження 5-IAF. При флуориметрическом детектуванні довжина хвилі збудження становила 473 нм, а емісії 514 нм. Встановлено, що використання 5-ІАФ дозволяє збільшити чутливість визначення НСУ методом КЗЕ з флуориметричним детектуванням.

Абсорбція, 492 нм Мал. 11. КЗЕ модельної суміші АТ, мо- Рис. 12. КЗЕ модельної суміші АТ, дифікованих 5-іодоацетамідо- модифікованих 5-іодоацетамідофлуоресцеїном з прямим УФ флуоресцеїном з флуориметричним Hcy-AF-100,0 мкМ, Cys-AF-300,0 мкМ, GS-AF 0 мкМ, Cys-AF-15,0 мкМ, GS-AFмкМ. (погл = 473 нм, ісп = 514 нм) 700,0 мкМ. (Погл = 492 нм).

Капіляр: внутрішній діаметр 50 мкм, повна Капіляр: внутрішній діаметр 50 мкм, повна довжина 68 см, ефективна довжина 53 см. Довжина 65 см, ефективна довжина 57 см.

Буфер: 25 мМ тетраборат натрію, 25 мМ фосфат Буфер: 25 мМ тетраборат натрію, 25 мМ фосфат натрію рН = 11,2. Напруга: 20 кВ. Сила струму: рН натрію = 11,2. Напруга: 20 кВ. Сила струму:

22 мкА. Температура: 25,0 оС. Час введення про-18 мкА. Температура: 25,0 оС. Час введення проби: 5 с (електрокінетично, напруга при б: 5 с (електрокінетично, напруга при розробці).

методом капілярного гель-електрофорезу Зміна вмісту молекулярних маркерів у фізіологічних рідинах також може бути обумовлена ​​генетичною схильністю пацієнта до конкретного захворювання. Звідси випливає необхідність проведення порівняльного аналізу фрагментів ДНК з метою підвищення достовірності визначення причин досліджуваного захворювання та ефективнішої його терапії.

У цій роботі досліджували можливість використання доступної вітчизняної КЕ апаратури для визначення мутацій у молекулах ДНК на прикладі фрагментів мутантного гена венозних тромбозів, із застосуванням аллельспецифічної ПЛР. Поділ нуклеотидів проводили методом капілярного гель-електрофорезу (КГЕ) із застосуванням немодифікованих капілярів із кварцового скла діаметром від 25 до 100 мкм. Як сепаративна матриця використовували лінійний полі-N,N-диметилакриламід (пДМА) вітчизняного виробництва. Вибір даного полімеру пов'язаний із можливістю його використання у чіп-варіанті КДЕ. пДМА синтезували у ЗАТ «Синтол» з мономеру диметилакриламіду шляхом радикальної полімеризації. Довжину ланцюга контролювали зміною температури або додаванням пасток радикалів. Використовували полімери, що містять 5-8% мономеру пДМА. В якості фонових електролітів застосовували 0,1 М TBE (0,1 М TRIS, 0,1 М борної кислоти і 2,5 мМ ЕДТА; рН = 8,3) та 0,1 М TAPS (N-триc(гідроксиметил)метил- 3-амінопропансульфонова кислота, рН = 8,3) Усі досліджувані полімери мали низький рівень нативної флуоресценції (0,5 AU). Полімери, приготовані з використанням 0,1М TAPS, дозволяють проводити до 5 розділень без перезаповнення капіляра гелем, у той час як ті, що містять TBE, допускали не більше 3. Зазначені полімери забезпечують роздільну здатність, порівнянну з відповідними західними аналогами, але при цьому більш доступні за ціною .

Дослідження суміші флуоресцентно мічених полінуклеотидів із довжинами 5-15н.о. відповідно при вмісті 10-9 М кожного з них дозволили визначити оптимальний склад полімеру для поділу олигонуклеотидов з довжиною ланцюга до 100 н. (Рис. 13). Таким є гель на основі пДМА, що містить 6% мономеру, 7М сечовини та 0,1М TAPS.

Рис. 13. Поділ суміші полінуклеотидів із довжинами Капіляр: внутрішній діаметр – 50 мкм, повна довжина – 45 см, ефективна довжина – 38,5 см. Полімер: 6% мономеру пДМА, 0,1М TAPS, 7M сечовина. Робочий електроліт: 0,1 М TAPS. Напруга:

10 кВ. Сила струму: 4,3 мкА. Температура: 25,0 оС. Час введення проби 10 с (електрокінетично, напруга при наборі проби – 10 кВ).

Оптимізація умов поділу (напруга, сила струму, ефективна довжина та діаметр капіляра) дозволила досягти поділу до базової лінії олігонуклеотиодів загальною довжиною менше 100 н. та різницею за довжиною 1 н.о. (Рис. 14.).

Рис. 14. Поділ суміші полінуклеотидів з різницею за довжиною 1 н.о.

Капіляр: внутрішній діаметр – 50 мкм, повна довжина – 65 см, ефективна довжина – 57,5 ​​см. Полімер: 6% мономеру пДМА, 0,1М TAPS, 7M сечовина. Робочий електроліт: 0,1 М TAPS. Напруга:

11 кВ. Сила струму: 5,1 мкА. Температура: 25,0 оС. Час введення проби 10 с (електрокінетично, напруга при наборі проби – 10 кВ).

Отримані дані були покладені в основу розробки системи швидкої та ефективної діагностики гена мутантного венозних тромбозів (Leiden гена фактора V системи згортання крові людини).

Для підтвердження можливості спільного визначення продуктів дикого та мутантного типів (різниця 5 н.о.) було проведено такі ПЛР: 1.

ДНК дикого типу (без мутації) + праймер дикого типу; 2. ДНК дикого типу (без мутації) + праймер FV Leiden; 3. ДНК із гетерозиготною мутацією FV Leiden + праймер FV Leiden; 4. Праймер FV Leiden без ДНК. Продукти реакції після обробки формамідом і розведення водою аналізували методом КДЕ з ​​флуориметричним детектуванням. Аналіз зразків 1 та 3 показав у суміші після ПЛР наявність продукту, а зразків 2 та 4 – його відсутність. Для підтвердження зазначеної закономірності був проведений аналіз суміші мутантний праймер/мутантний продукт і праймер дикого типу/продукт дикого типу у співвідношенні 1:1 (рис. 15).

Рис. 15. Спільне визначення мутантного та немутантного продукту ПЛР Капіляр: внутрішній діаметр – 50 мкм, повна довжина – 45 см, ефективна довжина – 38,5 см. Полімер 6% мономеру пДМА, 0,1М TAPS, 7M сечовина. Робочий електроліт: 0,1 М TAPS. Напруга: 12 кВ.

Сила струму: 6,5 мкА. Температура: 25,0 оС. Час забору проби: 10 с (електрокінетично, напруга при наборі проби – 10 кВ).

Отримані дані показують можливість спільного визначення продуктів аллель-специфічної ПЛР мутації FV Leiden та дикого типу. Запропонований підхід, а саме підбір та синтез аллель-специфічних праймерів різної довжини та загального зустрічного праймера з подальшим аналізом методом КГЕ з флуориметричним детектуванням, може бути поширений для діагностики та інших генетично обумовлених захворювань. Слід також відзначити можливість проведення аналізу олігонуклеотидів на вітчизняній стандартній апаратурі, що застосовується для аналізу амінокислот і коротких пептидів.

1. Розроблено методики аналізу генетично кодованих амінокислот без їх попередньої дериватизації методами міцелярної електрокінетичної хроматографії та капілярного зонального електрофорезу з рефрактометричним та прямим УФ детектуванням. Вивчено вплив складу та значення рН фонового електроліту, а також добавок органічних розчинників на ефективність поділу.

2. Методом міцелярної електрокінетичної хроматографії з прямим УФ детектуванням проведено кількісне визначення модельної суміші 14 вільних амінокислот, що генетично кодуються.

3. Розроблено методику швидкого та достовірного визначення вмісту низькомолекулярних амінотіолів у плазмі крові здорових та хворих пацієнтів методом обернено-фазової ВЕРХ з флуориметричним детектуванням. Показано важливу можливість застосування даної методики для визначення зниженого вмісту гомоцистеїну в плазмі крові. Розроблену методику апробовано на реальних зразках плазми крові пацієнтів.

4. Показано можливість визначення патологічно високих концентрацій гомоцистеїну у плазмі крові методом капілярного зонального електрофорезу з фотометричним детектуванням. Розроблену методику апробовано на реальних зразках плазми крові пацієнтів. Вивчено можливість застосування 5-іодоацетамідофлуоресцеїну як поглинаючої та флуорогенної мітки.

5. Розроблено методику селективного визначення фрагментів мутантного гена венозних тромбозів (мутація FV Leiden) методом капілярного гель-електрофорезу з флуориметричним детектуванням. Показано можливість аналізу нуклеотидів з довжиною ланцюга до 100 н. і з різницею по довжині 1 н.о.

Основні матеріали дисертації викладені у наступних роботах:

1. Мельников І.О., Назімов І.В., Стукачова Є.А., Глибоків Ю.М. Визначення вмісту гомоцистеїну та інших низькомолекулярних амінотіолів у плазмі крові. // Ж. Анал. Хім. -2006. -Т. 61. -№ 11. -С. 1185-1191.

2. Мельников І.О., Глибоків Ю.М., Назімов І.В. Капілярний електрофорез вільних амінокислот з рефрактометричним та прямим УФдетектуванням. / / Інф.-анал. бюлл. "Вчені записки МІТХТ". М.:

МІТХТ. -2004. Вип. 11. -С. 54-57.

3. Мельников І.О., Глибоків Ю.М., Назімов І.В. Аналіз низькомолекулярних амінотіолів методами капілярного електрофорезу та ОФ ВЕРХ з флуоресцентною та прямою УФ-детекцією. // Ж. «Сучасні наукомісткі технології». М: Академія Природознавства, -2005. -№3. -С.40-41.

4. Мельников І.О., Назімов І.В., Стукачева Е.А., Глубоков Ю.М. HPLC і HPCE визначення homocysteine ​​як criterion of vascular diseases risk factor. // FEBS J.-2006. -V. 273. -S.1. -P. 256.

5. Мельников І.О., Назімов І.В., Лобазов А.Ф., Попкович Г.В. Капілярний електрофорез немодифікованих амінокислот. // Тез. доп. 8-й Всеросійський симпозіум з молекулярної рідинної хроматографії та капілярного електрофорезу, Москва, жовтень 2001, С. 23.

6. Мельников І.О., Назімов І.В., Лобазов А.Ф., Попковіч Г.В. Capillary Electrophoresis Of Coded Nonmodified Amino Acids With Refractometric Detection. // 3rd International Symposium on Separations in BioSciences, Москва, травень 2003, P. 263.

7. Мельников І.О., Стукачова Є.А., Глибоків Ю.М., Назімов І.В. Визначення гомоцистеїну та інших низькомолекулярних амінотіолів плазми крові методами КЕФ та ОФ ВЕРХ. // Матеріали Міжнародної конференції студентів та аспірантів з фундаментальних наук «Ломоносів-2005».

М: МДУ, 2005. Секція хімія. -Т. 1. -С. 31.

8. Назімов І.В., Мельников І.О., Глибоків Ю.М., Сивоплясова Є.А. Інструментальні мікрометоди визначення гомоцистеїну як фактора ризику серцево-судинних захворювань. // Матеріали 2-ої науково-практичної конференції «Актуальні проблеми медичної біотехнології», Анапа, вересень 2005 р., -С. 15-16.

9. Мельников І.О., Назімов І.В., Сивоплясова Є.А., Глибоков Ю.М Мікрометоди кількісного визначення гомоцистеїну у плазмі крові. / / Матеріали 3-го з'їзду товариства біотехнологів Росії ім. Ю.А. Овчиннікова, Москва, жовтень 2005, -С. 61.

10. Мельников І.О., Сивоплясова Є.А., Глибоків Ю.М., Назімов І.В. Визначення фактора ризику серцево-судинних захворювань із використанням хроматографічних методів аналізу. // Матеріали 1-ої конференції молодих учених МІТХТ ім. М.В. Ломоносова, Москва, жовтень 2005, -С. 31.

11. Мельников І.О., Назімов І.В., Стукачева Е.А., Глубоков Ю.М. Separation and identification of blood low molecular weight aminothiols byперетворена фаза високої ефективності хімічної хроматографії та електронної капілярії. // International congress on analytical sciences ICAS-2006, Москва, червень 2006, -P. 204.

12. Мелніков І.О., Назімов І.В., Патрушев Л.І., Алексеев Я.І., Глубоков Ю.М., Мосін А.Г. Determination of human leiden gene mutation by high performance capillary gel electrophoresis. // 26th International Symposium on Separations of Proteins, Peptides and Polynucleotides, LMP, Інсбрук, Австрія, жовтень 2006, -P. 24.

Схожі роботи:

«КОПЧУК Дмитро Сергійович ФУНКЦІОНАЛІЗОВАНІ 5-АРИЛ-2,2'-БІПІРИДИНИ ТА ЇХНІХ ЛЮМІНЕСЦЕНТНІ КОМПЛЕКСИ З ЛАНТАНІДАМИ(III) 02.00.03. – Органічна хімія автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук Єкатеринбург 2010 Робота виконана на кафедрі органічної хімії ГОУ ВПО УГТУ-УПІ імені першого Президента Росії Б.М. Єльцина НАУКОВИЙ КЕРІВНИК: доктор хімічних наук Кожевніков Дмитро Миколайович ОФІЦІЙНІ ОПОНЕНТИ: доктор хімічних наук...»

«Венв Сергій Валерійович е Теоретичне вивчення впливу електростатичних взаємодій та первинної структури макромолекул на їх самоорганізацію 02.00.06 – Високомолекулярні з'єднання АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-математичних наук Москва – 2011 імені М.В. Ломоносова. Науковий керівник: лікар...»

«МИКОЛАЇВ АНДРЕЙ ОЛЕКСАНДРОВИЧ Т Е О Р ЕТ І ЧЕСКО О Е І Е К СП ЕР І МЕН ТАЛ ЬНЕ І ЗВУЧЕННЯ В ЗАЇ М О ДІЙ СТВ І Я КО М П Л ЕК С В М ЕТАЛ Л О В 6 І 1 0 ГР УП ПИС ДІ АЛ К І ЛФ О СФ І ТАМ І 02.00.08 – Хімія елементоорганічних сполук АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук Казань – 2008 Робота виконана на кафедрі високомолекулярних та елементоорганічних сполук. А. М. Бутлерова Державного...»

«Вілесов Олександр Сергійович РАДІАЦІЙНО-ХІМІЧНИЙ СИНТЕЗ ПОЛІМЕРНИХ ФОРМ ФОСФОРУ В РІЗНИХ СЕРЕДОВИЩАХ 02.00.01. – Неорганічна хімія АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук Москва 2009 Робота виконана в Інституті хімії та проблем сталого розвитку Російського хіміко-технологічного університету імені Д.І. Менделєєва Науковий керівник: член-кореспондент РАН, доктор хімічних наук, професор Тарасова Наталія Павлівна Офіційні...»

«Словохотов Юрий Леонидович АТОМНОЕ СТРОЕНИЕ И ОСОБЕННОСТИ КРИСТАЛЛОХИМИИ НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ФУЛЛЕРЕНОВ 02.00.03 – органическая химия 02.00.04 – физическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук Москва - 2007 Работа выполнена в Институте элементоорганических соединений имени А.Н.Несмеянова Российской академии наук Доктор хімічних наук, Офіційні...»

«Варнавська Ольга Олексіївна ФІЗИКО-ХІМІЧНІ ХАРАКТЕРИСТИКИ КОМПЛЕКСОУТВОРЕННЯ НЕОДИМУ (III) І ЄВРОПІЯ (III) З 2,2-ДИПІРИДИЛОМ В ОРГАНІЧНИХ СЕРЕДОВИЩАХ РІЗНИХ ПО2. фізична хіміяАвтореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук Томськ – 2010. Робота виконана в Алтайському державному університеті, м. Барнаул Науковий керівник: кандидат хімічних наук, доцент Смагін Володимир Петрович Офіційні опоненти: доктор...»

«Краснова Тетяна Олександрівна Мас-спектрометрія з матрично(поверхнею)активованою лазерною десорбцією/іонізацією при ідентифікації та визначенні олігомерів полісульфонових, полікарбонових кислот та антибіотиків 02.00.02 – аналітична хімія АВТОРЕФЕРАТ дисертація наук хімії Володимирського державного університету імені Олександра Григоровича та Миколи Григоровича...»

« АНАЛІЗА Спеціальність 02.00.02 – аналітична хімія АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук Томськ – 2012 www.sp-department.ru Робота виконана у Федеральній державній бюджетній освітній установі вищої професійної освіти Національний дослідницький...»

«СМИРНОВ Алексей Александрович ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В НЕРАВНОВЕСНОЙ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОЙ ПЛАЗМЕ HBr И ЕГО СМЕСЕЙ С АРГОНОМ, ГЕЛИЕМ И ВОДОРОДОМ 02.00.04 – Физическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Иваново 2010 Работа выполнена в ГОУ ВПО Ивановский государственный химикотехнологический университет . Науковий керівник: доктор хімічних наук, професор Єфремов Олександр Михайлович Офіційні опоненти:...»

«ВАСЮТИН Олег Алексеевич ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ УСЛОВИЙ СИНТЕЗА НА АДСОРБЦИОННЫЕ СВОЙСТВА ФЕРРОШПИНЕЛИ И ПОВЕРХНОСТНЫХ СВОЙСТВ ФЕРРОГРАНАТА ИТТРИЯ МЕТОДАМИ ПОТЕНЦИОМЕТРИИ И СМАЧИВАНИЯ Специальность 02.00.11 – коллоидная химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Санкт-Петербург 2012 Работа выполнена на кафедре коллоидной химии химического факультета Санкт -Петербурзького державного...»

«Мельникова Тетяна Ігорівна РОЗРОБКА ТЕОРЕТИЧНИХ І ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНИХ ОСНОВ ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ СКЛАДУ І СТРУКТУРНИХ ОСОБЛИВостей БОРАТІВ ВІСМУТУ І СИЛЕНІТІВ Спеціальність 02і00. твердого тілаАВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук Москва 2011 Робота виконана на кафедрі фізики та хімії твердого тіла Московського державного університету тонких хімічних технологій імені М.В. Ломоносова Науковий керівник: лікар...»

«Старостіна Ірина Олексіївна КИСЛОТНО-ОСНОВНІ ВЗАЄМОДІЇ ПОЛІМЕРІВ І МЕТАЛІВ В АДГЕЗІЙНИХ З'ЄДНАННЯХ 02.00.06 – Високомолекулярні з'єднання АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуток У1 Науковий консультант, доктор технічних наук, професор Стоянов Олег Владиславович Офіційні опоненти доктор...»

«ВАСІЛЬЄВ Володимир Петрович СПЕКТРАЛЬНО – ЛЮМІНЕСЦЕНТНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ МІЖМОЛЕКУЛЯРНИХ ВЗАЄМОДІЙ do МЕТАЛОЦІНОВИХ КОМПЛЕКСІВ Zr та Hf у РОЗЧИНАХ 02.00.04. – фізична хімія Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук Чорноголівка – 2008 Робота виконана в Інституті проблем хімічної фізики РАН та Педагогічному інституті Південного федерального університету Науковий керівник: кандидат хімічних наук ЛУКОВА Галина Вікторівна Офіційні...»

«ШПАНЧЕНКО Ольга Валеріївна ФУНКЦІОНАЛЬНА ТОПОГРАФІЯ ТРАНСПОРТНО-МАТРИЧНОЇ РНК 02.00.10 - біоорганічна хімія АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня доктора хімічних наук Москва - 2010 р.

«КОШЕЛЬОВА Катерина Валентинівна ТВЕРДІ ЕЛЕКТРОЛІТИ В СИСТЕМАХ CaY2S4-Yb2S3 та CaYb2S4-Y2S3 Спеціальність: 02.00.05 – Електрохімія АВТОРЕФЕРАТ дисертації Кіров Калініна Людмила Олексіївна, Науковий керівник: кандидат хімічних наук, доцент ФДБОУ ВПО Вятський державний університет,...»

«Лаврентьєва Катерина Костянтинівна Темплатування в системах, що містять глини, як метод управління властивостями полімер-композиційних сорбентів та платинових електрокаталізаторів Спеціальності: 02.00.06 – високомолекулярні сполуки 02.00.05 – електрохімія АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-математичних наук Москва – 2009 Робота виконана на кафедрі фізики...»

«Корчагіна Євгенія Вікторівна АГРЕГАЦІЯ ХІТОЗАНУ ТА ЙОГО ВИРОБНИХ У РОЗВЕДЕНИХ ВОДНИХ РОЗЧИНАХ державного університету...»

«Воробьева Екатерина Георгиевна ХИРАЛЬНЫЕ КОМПЛЕКСЫ ПАЛЛАДИЯ НА ОСНОВЕ АЗОТСОДЕРЖАЩИХ ПРОИЗВОДНЫХ ПРИРОДНЫХ МОНОТЕРПЕНОИДОВ 02.00.03 – Органическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Пермь - 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт химии Коми научного центра Уральского Отделения РАН и на кафедре химии ФДБОУ ВПО Сиктивкарський державний університет. Науковий керівник: Залевська Ольга...»

«Рыкунов Алексей Александрович ПЕРЕНОСИМОСТЬ КВАНТОВО-ТОПОЛОГИЧЕСКИХ АТОМНЫХ И СВЯЗЕВЫХ ДЕСКРИПТОРОВ В РЯДУ ЗАМЕЩЕННЫХ ГИДРОПИРИМИДИНОВ специальность 02.00.04 - физическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва - 2011 Работа выполнена на кафедре квантовой химии факультета естественных наук Российского химико-технологического университета им . Д.І. Менделєєва Науковий керівник: доктор фізико-математичних наук, професор...»

«КОРШУН Владимир Аркадьевич МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ПИРИМИДИНОВЫЕ НУКЛЕОЗИДЫ И НЕНУКЛЕОЗИДНЫЕ РЕАГЕНТЫ В СИНТЕЗЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ КОНЪЮГАТОВ, ИХ СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ 02.00.10 – Биоорганическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук Москва – 2012 Работа выполнена в Группе генетической инженерии интерлейкинов, Лаборатории механизмов экспрессии генов, Лабораторії хімії нуклеїнових кислот, Лабораторії органічного синтезу та Групі...»